基于HS-SPME-GC-MS和PCA的不同萃取頭對雞肉香精香氣成分萃取效果比較

于亞輝，陳沁雯，李曉婷，方婷

（福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

雞肉香精是以雞肉蛋白酶解物、糖類、氨基酸等兩種或兩種以上風味前體物質為原料，通過美拉德反應制備的一種咸味香精[1]。因其能夠較好地保持食品原有的天然風味，香氣柔和持久且具有多樣性而備受大眾青睞[2]。香氣是評價咸味香精品質的關鍵性指標之一，但在提取過程中由于揮發性香氣物質組成成分復雜、含量較低、不穩定極易被破壞，因此選擇合適的提取條件顯得極為重要[3]。

頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是一種較為常用的樣本采集技術，通過選擇性吸附富集樣品中揮發性及半揮發性成分，具有無需有機溶劑、樣品量少、靈敏度高及重現性好等優點，因其能夠較好的提取及評價樣品中的香氣成分[4]，故被廣泛應用于食品風味分析中[5]，但因萃取頭表面涂層的不同對各揮發物的萃取效果影響不同，所以選擇合適涂層的萃取頭也是進行揮發性物質分析的關鍵[6]。目前研究者多以揮發性物質的色譜峰面積及物質種類作為固相微萃取條件優化指標，錢敏等[7]采用不同萃取頭萃取豬肉香精樣品并經過（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析后，以峰面積及峰個數的差異選擇75 μm CAR/PDMS萃取頭為最適豬肉香精的萃取頭；董琪等[8]采用不同萃取頭萃取發酵牛肉腸樣品并經過GC-MS分析后，以總峰面積和物質總數為指標選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭為發酵牛肉腸的最適萃取頭；王學敬等[9]采用不同萃取頭萃取德州扒雞樣品并經過GC-MS分析后，以總峰面積和風味成分種類數為指標選擇75 μm CAR/PDMS萃取頭為最適德州扒雞的最優萃取頭。但由于在不同樣品中關鍵風味物質不同、閾值不同，對萃取條件的要求也不同，故僅以色譜總峰的大小及萃取物質的種類多少來判定萃取效果的好壞，不太可靠。為此，對固相微萃取方法的優化改進及如何采用多角度分析揮發性物質也引起了相關學者的關注，席嘉佩等[6]以烤羊肉為樣品結合主成分分析法研究了不同萃取頭與所萃取的揮發性物質之間的相關性，以靈敏度及共有香氣物質含量為指標，選擇出最適萃取烤羊肉的萃取頭；張德莉等[10]以香蔥油為樣品通過建立樣本間揮發性物質間的相關性分析模型，并結合聚類分析初步確定香蔥油的主要揮發性成分。

本研究采用常用的4種萃取頭對雞肉香精香氣成分進行萃取研究，探討不同萃取頭對萃取雞肉香精揮發性組成成分的影響，以分析出的總峰面積及物質種類含量及靈敏度為萃取頭選擇指標，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）法建立雞肉香精香氣品質的評價模型，從而選擇出最優的萃取條件，為后續咸味香精香氣物質的分析及萃取條件優化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

雞胸肉：福州永輝超市；復合蛋白酶（10萬U/g，食品級）：索萊寶試劑公司；動物蛋白酶（30萬U/g，食品級）：南寧龐博生物工程有限公司；葡萄糖、甘氨酸、硫胺素、半胱氨酸（均為分析純）：西格瑪試劑公司；牛磺酸（分析純）：潛江永安藥業股份有限公司。

AX523ZH型精密電子天平：奧豪斯公司；雷磁PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Centrifuge 5430R小型高速冷凍式離心機：德國艾本德股份公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；JYL-Y99高速破壁調理機：九陽股份有限公司；手動SPME進樣器：美國supelco公司；PerkinElmer GC680-SQ8T-HS4氣質聯用儀：美國珀金埃爾默公司。固相微萃取萃取頭型號見表1[4]。

1.2 方法

1.2.1 雞肉香精的制備

雞肉酶解液：雞胸肉絞碎至肉糜，料液比1∶4.4（g/mL），總加酶量0.82%，NaCl添加量0.8%，總時長7.3 h，分別在動物蛋白酶及復合蛋白酶最佳的pH值及最佳酶解溫度下進行分步酶解。

表1 固相微萃取萃取頭型號及使用條件Table 1 Model and conditions of solid-phase micro-extraction extraction head

雞肉香精的制備：取50 mL雞肉酶解液，依次按比例加入葡萄糖6%、甘氨酸2%、半胱氨酸0.09%、牛磺酸1%、硫胺素0.04%攪拌均勻，并使用磷酸緩沖溶液（pH 6.0）調節至pH 6.5，反應時間為55 min，反應溫度為100℃，60 r/min條件下進行反應。

1.2.2 SPME-GC/MS測定條件

采用頂空固相微萃取的方法進行風味物質提取，并利用氣質聯用儀進行揮發性物質成分分析。具體方法為：稱取雞肉香精5 g于20 mL頂空瓶中，將老化后的4種不同的萃取頭分別插入頂空瓶中，在55℃條件下萃取20 min，移至GC進樣口中解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為RTX-5MS石英毛細管柱，30 m×25 mm×0.25 mm；柱溫：初始溫度 40℃，保持2 min，以10℃/min升至260℃，保持10 min；進樣口溫度：280 ℃；載氣：氮氣；流量：1.0 mL/min；分流比：10 ∶1；質譜條件：采集方式：全掃描；質譜質量掃描范圍：35 amu ～450 amu；電離方式：電子轟擊；發射能量：70 eV；離子源溫度：250℃；接口溫度：260℃。

將檢測到的質譜信息與NIST和Wiley這2個質譜數據庫進行匹配，正反相匹配指數均大于800（最大為1 000）或單個大于850的化合物進行選擇確定，結合手動檢索進行定性，采用面積歸一法進行定量，并對揮發性成分的相對含量進行計算。

1.2.3 不同萃取頭萃取化合物靈敏度的比較

使用累積峰面積標準化值[3，11（]cumulative area normalization value，CANV）對雞肉香精揮發性化合物的萃取靈敏度進行評價。

1.3 數據分析

揮發性含量表示為峰面積，采用Excel 2016進行數據處理計算，使用SPSS 21.0和origin 2017進行相關統計分析及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 4種萃取頭對雞肉香精中揮發性成分GC-MS分析

剔除硅氧烷類雜質峰，對不同萃取頭萃取雞肉香精得到的揮發性化合物根據保留時間及峰面積重新作圖，結果見圖1。

圖1 4種萃取頭萃取雞肉香精中揮發性物質總離子流色譜圖比較Fig.1 Comparison of total ion chromatograms of volatile substances extracted from chicken flavors with 4 kinds of extraction heads

結合氣質分析結果對比發現，75 μm CAR/PDMS萃取頭對雞肉香精的萃取效果明顯高于其它3種，共萃取得到138種揮發性化合物，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（129種）和 65 μm PDMS/DVB萃取頭（123種），而85 μm PA萃取頭萃取得到化合物最少為52種，4種萃取頭一共得到146種揮發性物質，其中75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取到了94.5%的化合物。不同萃取頭萃取得到的化合物總峰面積與化合物數量也有著類似趨勢，CAR/PDMS（6.7×107）>DVB/CAR/PDMS（5.0×107）>PDMS/DVB（4.6×107）>PA（6.0×106），與復合涂層材料的萃取頭相比單一涂層的萃取效率較低。

2.2 不同萃取頭萃取揮發性物質數量及相對含量比較

萃取頭萃取雞肉香精香氣成分數量及相對含量比較見圖2和圖3。

圖2 4種萃取頭萃取雞肉香精香氣成分數量比較Fig.2 Comparison of aromatic components in chicken flavor extracted by 4 kinds of extraction heads

圖3 4種萃取頭萃取雞肉香精香氣成分相對含量比較Fig.3 Comparison of relative contents of aroma components extracted from chicken flavors with 4 kinds of extraction heads

加熱過程中的化學反應產生了各種賦予樣品風味的化合物，目前已報道的雞肉風味中存在的揮發性風味物質已經超過600種，包括醇、醛、酮、吡嗪、呋喃等[12-13]。通過質譜軟件TurboMassVer6.1.0對4種萃取頭萃取到的揮發性物質進行定性及定量分析，并根據化合物種類的不同將揮發性物質分為醇類、醛類、酮類等11類。由圖2可以看出，CAR/PDMS的萃取頭對醇類、醛類、呋喃（酮）類、芳香類化合物、雜環類及其它類化合物的萃取效果明顯優于其它3種萃取頭；DVB/CAR/PDMS的萃取頭對酯醚類、烴類化合物的萃取效果優于其它3種萃取頭；CAR/PDMS和DVB/CAR/PDMS的萃取頭均萃取出6種酮類化合物、9種含硫化合物、12種吡嗪類化合物，其中PDMS/DVB的萃取頭也萃取出12種吡嗪類化合物，均強于PA的萃取頭。結合圖1就分析對象來看，PDMS/DVB、CAR/PDMS和 DVB/CAR/PDM的萃取頭均適用于雙極性揮發性物質，特別是對低沸點物質的萃取效果較強，在保留時間15 min之前萃取出的峰較為尖銳，具有較好的萃取效果，PA的萃取頭多用于萃取極性或半極性的物質，對萃取雞肉香精中的揮發性物質不占有優勢。就相對含量（圖3）來看，CAR/PDMS萃取頭萃取的醇類化合物相對含量較高為27.48%，其次為烴類化合物（15.61%）、含硫化合物（9.95%）和雜環類及其它化合物（9.71%）等；DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取的醇類化合物相對含量也較高為26.39%、烴類化合物（21.87%）、雜環類及其它化合物（14.5%）、含硫化合物（11.33%）等；PDMS/DVB萃取頭萃取的醇類化合物最高為27.51%、雜環類及其它化合物（17.95%）、含硫化合物（13.95%）、烴類化合物（8.88%）等；PA萃取頭萃取的烴類化合物（39.48%）和醇類化合物（32.99%）共計72.47%，是其最主要的兩類化合物。使用傳統方法對比分析4種萃取頭的萃取效果時發現，4種萃取頭對各揮發性物質的萃取能力具有差異性，但就整體呈現性來看，除PA萃取頭外其余三者的萃取結果具有一定的相似性，不能很好地選擇出最優的萃取頭。

2.3 不同萃取頭靈敏度比較

同一化合物應在同一時間或一定時間范圍內出峰，根據萃取頭不同的吸附能力及各化合物極性或非極性性質，會導致同一化合物對應的峰面積不同，在同一保留時間下化合物的累積峰面積標準化值越大，則認為該萃取頭對此化合物的萃取靈敏度越高，萃取效果越好，靈敏度的高低可能與峰的分離效果有關[14]。根據公式[3，11]計算不同萃取頭對應不同種類化合物的累積標準化值，4種萃取頭對不同種類化合物的萃取靈敏度見圖4。

由圖4可知，CAR/PDMS的萃取頭對醇類、酮類、醛類、酯醚類、吡嗪類、呋喃（酮）類、烴類化合物、含硫化合物、芳香類化合物、雜環類及其它化合物均具有最大的CANV值，萃取效果較為明顯，而PA的萃取頭萃取雞肉香精中揮發性成分的CANV值均較小，萃取效果不明顯。且隨著時間的延長，除醇類外CAR/PDMS的萃取頭對其它種類化合物的CANV值的增長趨勢明顯高于其它種類萃取頭，表明CAR/PDMS的萃取頭對雞肉香精中揮發性物質的萃取效果優于其它萃取頭。

圖4 不同萃取頭不同種類物質的累積標準化值Fig.4 CANV of different types of substances in different extraction heads

2.4 主成分分析

主成分分析是一種重要的降維分析方法，可使用包含主要信息的主成分來替代原始數據進行分析[15]，并反映出較多的樣本信息。首先，對4種萃取頭所萃取雞肉香精中揮發性成分的相對含量作KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）和Bartlett球形檢驗，發現系數為0.637>0.5，P值<0.05，數據呈球形分布，說明4種萃取頭萃取得到的各種類揮發性物質相對含量間相關度較高，可以進一步進行主成分分析研究不同萃取頭與各種類揮發性物質間的相關關系。

2.4.1 雞肉香精香氣成分主成分分析

利用SPSS21.0軟件對4種萃取頭所萃取的雞肉香精中揮發性香氣成分相對含量進行主成分分析，選取特征值>1的成分為主成分，主成分分析結果見表2。

表2 2個主成分的特征值及貢獻率Table 2 Eigenvalues and contribution rates of the 2 principal components

根據表2可知，前2個主成分的累計貢獻率達到91.24%，基本可以有效地解釋所有變量的原有信息。

雞肉香精香氣成分的主成分特征向量及載荷矩陣見表3。

表3 主成分的特征向量和載荷矩陣Table 3 Eigenvectors and load matrices of principal components

由表2和表3可知，第一主成分的貢獻率為55.599%，主要反映的是醇類、呋喃（酮）類、烴類化合物和含硫化合物4類香氣成分的變異信息，且第一主成分與醇類和烴類化合物呈負相關關系，與呋喃（酮）類和含硫化合物呈正相關關系；第二主成分的貢獻率為35.641%。各個主成分在各變量因子之間的載荷值表示該主成分對該因子所能反映的真實程度，主要反映的是吡嗪類和芳香類化合物2種香氣成分的變異信息，且均呈正相關關系。

2.4.2 基于主成分分析建立雞肉香精香氣品質評價模型

根據表2和表3，兩個主成分可以解釋4種萃取頭11類香氣成分91.24%的變異信息，并根據其特征向量，以F1和F2兩個新的綜合指標來代替原來的11類香氣成分所表達的信息，建立雞肉香精香氣成分的評價模型，進行香氣品質綜合評價，并得到線性關系式分別為：F1=-0.372X1+0.301X2+0.262X3+0.311X4+0.043X5+0.346X6-0.397X7+0.398X8-0.03X9+0.319X10+0.257X11，F2=-0.062X1+0.269X2-0.287X3+0.316X4+0.467X5+0.237X6-0.017X7-0.085X8+0.495X9-0.31X10-0.344X11。

式中：F1和F2分別代表綜合主成分值得分，得分值越大，代表萃取頭萃取效果越好。對表3中的特征向量進行標準化處理，并與所對應的兩個主成分的貢獻率做內積，得到綜合香氣品質的評價函數表達式為：F=0.555 99F1+0.356 41F2。

根據評價函數表達式得到綜合得分值及排序，見表4。主成分分析結果見圖5。

表4 標準化后主成分綜合得分表Table 4 Comprehensive scores of principal components after standardization

第一主成分得分最高的是PDMS/DVB萃取頭，第二主成分得分最高的是CAR/PDMS萃取頭，結合圖5來看，4種萃取頭萃取的香氣成分經過主成分分析表現出了明顯的差異，綜合評分中CAR/PDMS萃取頭得分最高，萃取效果最好，其次為PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS及PA萃取頭。

圖5 主成分分析結果Fig.5 Principal component analysis results

3 結論

1）通過GC-MS分析，比較研究4種常用的SPME涂層萃取頭（75μmCAR/PDMS、65μmDVB/PDMS、85μm PA、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）對雞肉香精有效揮發性成分的提取性能，研究發現僅比較萃取得到的物質峰面積及數量難以有效篩選出最優萃取頭；經過萃取頭靈敏度檢驗、主成分分析建立雞肉香精風味評價模型后發現75 μm CAR/PDMS萃取頭綜合得分最高，是萃取雞肉香精揮發性物質的最優萃取頭。

2）經檢測后發現4種萃取頭共從雞肉香精中萃取到146種揮發性物質，物質成分復雜豐富，包括醇類、醛類、吡嗪類、呋喃（酮）類、含硫化合物、雜環類及其它化合物等香氣物質，萃取到2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基-3-戊烷硫醇、反式-2，4-癸二烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛及反式-2-壬烯醛等多種關鍵肉香味化合物。

3）通過建立雞肉香精風味評價模型篩選出最優萃取頭，對其它樣品香氣物質的萃取及條件優化提供了一定的借鑒，可繼續探索建立模糊數學評判法、主成分分析法等不同評價模型對揮發性物質萃取條件的優化。