提高雨生紅球藻細胞密度發酵工藝的優化研究

赫春青，陳開陽，師三媛，肖冬光，范志華，劉智永，陳方見

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300380；3.中國科學院天津工業生物技術研究所天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308）

雨生紅球藻（Haematococcus plivialis）是自然界中天然蝦青素含量最高的物種，含量可達細胞干重的7%[1]。蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有極強的抗氧化能力，其抗氧化能力約為其它類胡蘿卜素的10倍[2]，遠遠強于其它普通抗氧化物質，因而被廣泛應用于飼料、保健品、化妝品等多個領域[3]。但與其它微生物相比，雨生紅球藻光自養培養存在生長較慢、環境適應能力較差的缺點[4]。在雨生紅球藻生活史中存在多種細胞形態，國際上存在多種分類，劉建國等[5]則將雨生紅球藻歸納為游動與不游動狀態，研究發現在游動期間細胞活力強、繁殖快，受到外界脅迫會由游動形態轉變為不游動形態，期間多伴隨蝦青素的積累[3]。目前雨生紅球藻誘導生產蝦青素的方法主要包括營養脅迫和光脅迫兩種[6-8]，方法已經比較成熟，但雨生紅球藻光自養生長緩慢難以達到很高的培養密度，導致其在大規模生產蝦青素過程中成本較高。

雨生紅球藻培養過程中會吸收培養基中的營養鹽使得pH值增長過快，當pH值達到一定高度時會抑制藻細胞的生長[9]，因此控制培養基中的pH值對于提高細胞密度具有重要作用。雨生紅球藻和植物的生長類似，它的生長受激素的調節，在培養基中添加一定量的植物激素[10]可促進藻細胞的增殖。雨生紅球藻既可以自養生長也可以異養生長，有關報道指出，雨生紅球藻可以利用乙酸鈉作為碳源進行培養，但乙酸鈉添加量因藻種而異[11-12]。本試驗旨在利用發酵培養代替光自養培養雨生紅球藻，通過改變培養基成分以及環境條件提高該藻的培養密度，進而降低雨生紅球藻培養的成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻（H.plivialis）NIES-144藻株：日本國立環境研究所。硝酸鈣、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鐵、生物素（均為分析純）：天津市江天化工技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-1NDII超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LI-250A光照強度測量儀：廣州市宏誠集業電子科技有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋：北京艾德萊生物科技有限公司；420P-01A pH計：梅特勒-托利多國際有限公司；ZWYR-2112B恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；101-0A鼓風干燥箱：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的配制

微量元素儲備液：FeCl3·6H2O 0.196 g/L、MnCl2·4H2O 0.036 g/L、ZnSO4·7H2O 0.022 g/L、CoCl2·6H2O 4 mg/L、Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L、Na2EDTA·2H2O 1 g/L、初始pH值為7.5，121℃滅菌20 min。

C 培養基：Ca（NO3）2·4H2O 0.15 g/L、KNO30.1 g/L、β-甘油磷酸二鈉 0.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.04 g/L、微量元素儲備液 3 mL、維生素 B110 μg/L、生物素 0.1 μg/L、維生素B120.1 μg/L、三羥甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]0.5 g/L。

1.3.2 微藻的培養

使用三角瓶在恒溫搖床中間歇振蕩培養，搖床120 r/min振蕩1 min，轉速降為30 r/min振蕩20 min，兩種轉速間歇運行。光照強度為10 μmol/（m2·s），溫度為25℃。定期取樣，分別檢測細胞密度、生物量、pH值等數據。

1.3.3 初始乙酸鈉濃度的影響

將乙酸鈉按照 0、5、10、15、20、25 mmol/L 的濃度分別加到培養基中進行培養。培養6 d后分別取樣檢測細胞密度。

1.3.4 初始pH值優化

將培養基的初始pH值調節為7.0、7.5、8.0、8.5進行培養。每天分別取樣檢測細胞密度和pH值。

1.3.5 接種量的影響

將雨生紅球藻分別按照15%、20%、25%、30%的接種量進行培養。每天分別取樣檢測生物量干重。

1.3.6 發酵條件的正交試驗

選擇培養時間、乙酸鈉濃度、初始pH值和接種量4個因素，各取3個水平，以L9（34）正交表進行正交試驗，以得到最優的條件組合，設計見表1。

表1 發酵條件的L9（34）正交試驗設計Table 1L9（34）Orthogonal designation of fermentation conditions

1.3.7 不同植物激素的應用及組合使用的影響

將植物 3-吲哚丁酸（3-indolebutyric acid，3-IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）以L9（34）正交法進行試驗，得出最優的激素配比，設計見表2。

1.4 計算分析

1.4.1 細胞密度的測定

取1 mL藻液10 000 r/min離心1 min，濃縮至合適濃度，使用血球計數板計數。

表2 激素組合的L9（34）正交試驗設計Table 2L9（34）Orthogonal designation of hormone combination

式中：N為5個中方格的細胞總數，個；a為稀釋倍數。

1.4.2 生物量干重的測定

采用0.22 μm纖維濾膜，105℃烘干稱重，記錄初始質量m1。吸取V體積藻液抽濾，105℃烘干再次稱重，記錄質量m2。

式中：m1為烘干后濾膜質量，g；m2為經抽濾并烘干后濾膜質量，g；V為抽濾體積，L。

1.4.3 數據分析

采用origin進行圖的繪制。使用正交試驗設計助手專業版軟件進行極差及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗的影響

2.1.1 雨生紅球藻的生長曲線

雨生紅球藻生長曲線試驗結果如圖1所示。

圖1 雨生紅球藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of H.plivialis

由圖1可知，接種后隨培養時間的增加細胞密度逐漸增大。0 ～1 d細胞密度增長緩慢，1 d ～2 d生長較快，2 d ～4 d生長速率最大。第6天生長速度趨于平緩，第8天細胞密度達到最大值，經血球計數板的測定細胞密度達到4.17×104個/mL。超過第8天，細胞密度開始逐漸減小。

2.1.2 乙酸鈉濃度對細胞密度的影響

培養基中不同濃度乙酸鈉對細胞密度的影響如圖2所示。

圖2 乙酸鈉濃度對雨生紅球藻細胞密度的影響Fig.2 Effect of sodium acetate on cell density of H.plivialis

由圖2可知，添加乙酸鈉對雨生紅球藻的生長具有促進作用。在0 ～15 mmol/L范圍內，乙酸鈉的濃度為5 mmol/L時細胞密度相對較大，達到1.675×105個/mL，比不添加乙酸鈉的細胞密度提高了一倍。在顯微鏡下觀察，乙酸鈉的濃度達到20 mmol/L以后雖然雨生紅球藻生物量干重更高，但此條件下細胞開始出現變黃甚至變紅。

雨生紅球藻在快速增殖過程中需要消耗大量的碳源，但在自養培養過程中泵入無菌空氣含有的CO2不能滿足其快速生長的需要，所以培養過程需要不斷補充無機碳源或添加有機碳源乙酸鈉[13]。大量研究表明在適宜異養或兼養條件下，雨生紅球藻繁殖速度和穩定期細胞密度相較于光自養都有所提高，但不同藻種的最適乙酸鈉濃度有所不同[14-16]。本研究表明，乙酸鈉濃度在0 ～15 mmol/L范圍內，藻細胞一直保持綠色游動狀態，在5 mmol/L濃度下出現峰值；在添加較高濃度乙酸鈉（大于20 mmol/L）下，雨生紅球藻的細胞密度有較大提高，但是游動細胞的數量大幅降低，細胞顏色逐漸變紅，開始合成類胡蘿卜素物質，不利于細胞密度的進一步提升。所以在發酵初始階段添加濃度低于15 mmol/L的乙酸鈉可以快速提高細胞密度。

2.1.3 藻液初始pH值的影響

初始pH值對細胞密度變化的影響如圖3所示。可知，初始pH值在7.5時藻液細胞穩定期濃度最大，接種后前2 d雨生紅球藻增長情況不明顯，2 d之后不同培養基初始pH值下雨生紅球藻的生長速度差別較大，從高到低 pH 值依次為 7.5、8.0、8.5、7.0。

圖3 初始pH值對雨生紅球藻生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on growth of H.plivialis

圖4 不同初始pH值培養基中pH值的變化情況Fig.4 pH curve of the culture with different initial pH

在培養基的初始pH值不同的情況下，對其pH值的變化進行測定，結果如圖4所示。圖4可觀察到培養基初始pH值為7.0 ～8.5，接種后pH值均快速上升，第2天藻液的pH值穩定在9左右，并逐漸趨近于9.3。研究發現，pH值低于9時雨生紅球藻生長速率慢，pH值在9附近時生長速率加快，pH值高于9生長速率開始快速下降甚至停止。

有研究發現雨生紅球藻的生長pH值范圍較為寬廣，但在高pH值下生長緩慢[17]。由圖4試驗結果可知，藻液的最終pH值穩定在9.3，說明該藻株可生長pH值上限可能為9.3，pH值高于9.3不利于細胞生長。從細胞密度變化可以看出，接種量一定時，培養基的初始pH值對藻種的生長有一定的影響。初始pH值過低，在接種的過程中會使一部分藻種死亡，初始pH值過高，在接種時有利于藻種的生長，但隨著培養pH值快速增加，不利于藻種的繁殖。

2.1.4 接種量對藻株生長趨勢的影響

在微生物發酵過程中，接種量是一個重要的研究條件。雨生紅球藻的發酵也是如此，適宜的接種量不僅關系到藻細胞對培養基中營養物質的吸收，更關系到細胞的生長速度與穩定期細胞密度[14]。接種量對生物量的影響如圖5所示。

圖5 接種量對雨生紅球藻生長的影響Fig.5 Effect of inoculation quantity on growth of H.plivialis

從圖5比較不同接種量的雨生紅球藻增長趨勢可知，接種量大時，雨生紅球藻進入生長期時間縮短，同時進入穩定期的時間也縮短，穩定期生物量干重也略有提高，接種量不小于20%雨生紅球藻穩定期生物量干重相差不大，但接種量低于20%生物量干重較低，僅達到0.11 g/L。在接種量較低時，雨生紅球藻進入生長期和穩定期時間都會出現延遲，但都會在培養到第5天進入穩定期。從研究結果可以看到雨生紅球藻接種后第1天生物量干重并沒有增長，從第2天細胞都開始增殖，不同的接種量差別較大，接種量越大增長越快，最終穩定在0.2 g/L左右。接種量為15%時增長緩慢，穩定期生物量干重低，只有0.1 g/L。

2.2 發酵條件的正交試驗結果

通過單因素試驗探究了雨生紅球藻的適宜生長條件，考慮多種因素之間的相互影響，進行了四因素三水平L9（34）正交試驗對發酵工藝進一步優化，試驗結果如表3、表4所示。

表3 發酵條件的正交試驗結果和極差分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal experiment on fermentation conditions

表4 發酵條件正交試驗的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment on fermentation conditions

表3中的極差分析結果表明，各因素對細胞密度的影響依次是培養時間、乙酸鈉、接種量、初始pH值。雨生紅球藻的最佳工藝條件為A3B2C1D3，最優組合恰好為表3中第8組試驗，即培養時間11 d，乙酸鈉濃度10 mmol/L，初始pH值為7.5，接種量30%，得到的最佳優化條件下雨生紅球藻的細胞密度可達到7.3×105個/mL。

2.3 植物激素的正交試驗結果

不同植物激素組合條件對藻液細胞密度的影響，試驗結果如表5、表6所示。

表5 激素組合的正交試驗結果和極差分析Table 5 Results and range analysis of orthogonal experiment on hormone combination

表6 激素組合正交試驗的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment on hormone combination

由表5可得，植物激素對雨生紅球藻的高密度培養具有一定的促進作用，添加激素的細胞密度均高于未添加激素藻液的最高細胞密度。各因素對藻液細胞密度的影響依次是 2，4-D、NAA、6-BA、3-IBA，得到激素的組合最佳工藝條件為A2B2C2D2，即3-IBA、2，4-D、NAA、6-BA 添加量分別為 0.5、0.1、0.01、0.1 mg/L；經試驗驗證，在該條件下細胞密度為1.17×106個/mL。

報道指出激素對藻類的生長具有促進作用，黃偉卿、岳陳陳等[18-20]研究了不同激素單獨和組合應用對雨生紅球藻生長的影響，并且取得了有效的成果，由此可見添加植物激素對微藻生長具有一定的影響作用。在本研究中，選用了4種植物激素進行研究，通過正交試驗結果得出這些激素在適宜濃度下對雨生紅球藻的生長都具有促進作用，其中2，4-D和NAA對試驗結果影響較大。添加激素優化后，最終雨生紅球藻的細胞密度可達1.17×106個/mL，比優化之前提高28倍。

3 結論

本研究得到適合雨生紅球藻NIES-144發酵培養的最佳工藝：發酵培養周期為11 d，碳源乙酸鈉添加量為10 mmol/L，初始pH值為7.5，接種量控制在30%，添加植物激素可以提高細胞密度，激素3-IBA、2，4-D、NAA 和 6-BA 的添加量分別為 0.5、0.1、0.01、0.1 mg/L，優化后發酵雨生紅球藻的細胞密度可達1.17×106個/mL，比優化之前提高28倍。本研究為雨生紅球藻發酵培養提供必要的依據，如何規模化應用還需進一步優化。