基于全外顯子測序技術分析胰腺導管癌體細胞突變與患者臨床特征的關系

宋瑤琳 紀彬彬 劉相蘭 楊平 王博 梁樂彬 王愛蘭 楊家亮 田埂 邢曉明

(1 青島大學附屬醫院病理科，山東 青島 266021； 2 元碼基因科技(北京)股份有限公司； 3 煙臺毓璜頂醫院病理科)

胰腺癌是高度致死性的惡性腫瘤之一，死亡率居全球第四。大多數胰腺癌患者確診時已無法通過手術切除病灶，治療的中位生存期僅6～9個月，5年生存率低于5%，而行手術治療后患者的生存率也不足25%。因此，胰腺癌的診療是目前面臨的主要挑戰之一[1-2]。盡管全球范圍內已針對胰腺癌進行了數十年的基礎和臨床轉化研究，但僅有極少數新療法進入了臨床批準階段[3]。胰腺癌患者的不良預后主要歸因于胰腺癌細胞的快速轉移，因此了解胰腺癌細胞轉移的遺傳分子機制，對于進行有效的靶向治療至關重要。

近年來，下一代測序技術在胰腺癌發生發展分子機制的研究中廣泛應用[4]，在揭示胰腺癌的遺傳基礎、基因突變和發現新的驅動基因方面發揮了重要作用。識別胰腺癌體細胞突變和臨床特征之間的相關性，發現新的腫瘤基因組生物標記物，有利于對患者進行更加精準治療[5-6]。本研究應用胰腺導管癌(PDAC)患者的腫瘤組織進行外顯子組測序，并應用COSMIC數據庫驗證體細胞單核苷酸多態性(SNP)位點，評估依靠單樣本測序數據識別致癌體細胞突變的可行性；同時，分析鑒定致癌體細胞突變與患者臨床病理特征之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與外顯子組測序

收集2009—2011年在青島大學附屬醫院行手術切除的PDAC患者的腫瘤組織樣本40例，患者術前均未接受過放療以及化療治療。該研究獲得青島大學附屬醫院倫理委員會的批準(審批號QDFY WZLL 26052)，并嚴格按照《人類和動物權利聲明》以及《赫爾辛基宣言》執行。 40例患者當中男22例，女18例；年齡43～80歲，其中43～60歲者18例，61～80歲者22例；發病部位于胰體/胰尾者20例，胰頭者20例；臨床分期Ⅰ期者7例，Ⅱ期者18例，Ⅲ期者5例，Ⅳ期者10例；腫瘤組織高分化者2例，中分化者15例，低分化者23例。根據不同臨床特征將樣本分為不同的亞組：按照腫瘤分期分為Ⅰ/Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組2個亞組；高分化組僅有2例，無統計意義，因此本研究按照腫瘤組織分化程度分為中、低分化組2個亞組。

取PDAC患者的腫瘤組織樣本甲醛固定并石蠟包埋，通過QIAamp DNA試劑盒(Qiagen公司，美國)提取基因組DNA并進行片段化處理后，構建DNA測序文庫，并與安捷倫人類全外顯子靶向富集V1(Agilent Technologies，美國)雜交，得到捕獲產物，純化后用以擴增形成全外顯子組。再通過Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific，美國)和Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，美國)對全外顯子組進行質檢，質檢合格后于Illumina NovaSeq(Illumina，美國)測序儀上進行150個堿基末端配對測序，測序深度為77～251X，平均深度為153X，獲得樣本中的外顯子組結果。

1.2 致癌體細胞突變分析

1.2.1致癌體細胞突變篩選 將Illumina測序堿基質量值轉換為Sanger標準測序堿基質量值，默認算法為Burrows-Wheeler Aligner(BWA)算法(版本0.7.0)，將測序結果與人類參考基因組(Hg19)進行比對，并過濾掉比對到基因組多處的序列。然后，應用基因組分析工具包(GATK)和Maftools R包對過濾后的數據進行分析。為提高致癌體細胞突變檢測結果的可信度，首先通過COSMIC數據庫(突變均來自于體細胞)過濾并下載VCF文件，過濾條件如下：將注釋為COSMIC癌癥體細胞突變目錄數據庫包含的常見SNP或非編碼基因變異過濾掉；然后再通過隱馬爾可夫模型的功能分析工具進一步過濾掉FATHMM數據庫中沒有標注為致病性的突變；最后過濾掉突變比率低于5%或唯一比對但序列數量小于10的變異。最終剩余的數據用于致癌體細胞突變分析。

1.2.2TCGA突變數據比較 在TCGA數據庫中下載PDAC臨床測序數據及對應的臨床資料，并應用MuTect2軟件生成突變注釋格式(MAF)文件。MAF文件中的致癌體細胞突變過濾標準如下：測序深度≥10，突變比率≥5%，突變類型設定為錯義突變、同義突變，SIFT選擇有害，生物類型選擇蛋白編碼，ExAC_AF<1%，FILTER選擇PASS；臨床資料的過濾標準設置為：腫瘤病理類型為PDAC，腫瘤發病部位包括胰頭、胰體或胰尾。

1.3 PDAC腫瘤組織樣本基因突變的通路分析及基因突變互斥性與共現性分析

按照協同和互斥的表現形式，將突變模式分為共現性和互斥性。使用MAFtools函數somatic Interactions對選中的基因突變兩兩之間進行Fisher檢驗，分析基因突變的共現性。在進行互斥性分析時，同時對基因兩兩之間進行分析，按照有無突變構建2×2的列聯表，并采用CoMEt(Combinations of Mutually Exclusive Alterations)確定腫瘤中相互排斥變化組合的統計方法,CoMEt包括針對互斥性的精確統計測試，以及對多組互斥和特定于子類型的變更進行同時分析的技術，通過CoMEt檢驗法計算顯著性，可以尋找包含>2基因的互斥基因集。

1.4 PDAC腫瘤組織的基因突變與臨床病理特征關系分析

使用KEGG數據庫分析PDAC腫瘤組織樣本基因突變的數量和百分比，通過費舍爾提取測試方法分析臨床特征各亞組與基因突變之間的關系。

1.5 統計分析

采用Python軟件完成統計與分析，通過χ2檢驗分析臨床特征各亞組與基因突變之間的關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDAC腫瘤組織樣本的全外顯子組測序結果

40例PDAC腫瘤組織樣本共發現1 446處致癌體細胞突變位點，涉及759個基因，每例樣本包含25～82處致癌體細胞突變位點。PDAC腫瘤組織樣本的檢測平均覆蓋率為99.2%，PDAC腫瘤組織樣本產生的高質量堿基長度平均為15.8×109bp，可與人類參考基因組序列唯一比對的堿基序列占比為84.3%。

2.2 PDAC腫瘤組織樣本中致癌體細胞突變類型分析和突變譜鑒定

對PDAC腫瘤組織樣本中致癌體細胞的突變類型進行統計，樣本體細胞突變類型中構成比占前3位的分別為C>A突變、C>T突變、T>A突變，分別占48%、45%、6%，每例樣本中均包含有上述3種類型基因突變，其中堿基顛換(Tv)的構成比為 56.8%，堿基轉換(Ti)的構成比為 43.2%。

在發現的致癌體細胞突變中，每個PDAC腫瘤組織樣本平均有38個錯義突變，2個同義突變(圖1A)；在1 446處致癌體細胞突變中對突變的體細胞進行分析，排名前10位的突變基因名稱及其百分比如圖1B所示。本研究對PDAC的腫瘤分期的每個樣本的平均突變數量進行分析，其中PDAC臨床分期為Ⅰ期的突變數量為42個，Ⅱ期為40個，Ⅲ期為37個，Ⅳ期為42個，致癌體細胞突變的數量在腫瘤的不同分期中無顯著差異(圖1C)。TCGA數據庫中PDAC致癌體細胞突變的平均數量為45個，本研究中的PDAC樣本測序數據集中在40個左右的范圍，總體和TCGA數據庫中PDAC測序數據相符，突變數量與TCGA數據庫相比，分布更為集中(圖1D)。

A：錯義突變和同義突變數量的箱線圖；B：突變百分比前10位基因的名稱及其百分比；C：不同腫瘤分期的體細胞突變情況比較；D：TCGA數據庫中不同類型腫瘤的致癌體細胞突變數量分布圖，其中灰色點表示突變數量的范圍，紅色線表示突變數量的平均數

2.3 PDAC腫瘤組織樣本中突變基因的相關信號通路分析及基因突變互斥性、共現性分析

本研究針對單個PDAC腫瘤組織樣本突變精準研究結果如圖2A所示，其中每列代表一個樣本，綠色和紅色標記相應的突變位點和突變總數量，單個樣本包含的突變數量為40個左右，其中1個樣本突變數量為82個，同一樣本中同時含有KRAS與TTN基因雙突變的數量最多，KRAS與RLIM基因雙突變的頻率排名第二，而在不含有KRAS基因突變的樣本中，高雙突變樣本多包含RLIM基因突變，同時本樣本中同義突變集中于TP53和TTN基因。對PDAC腫瘤組織樣本中突變基因的相關信號通路進行分析，顯示涉及到的信號通路共10個，分別為7tm_1、 FN3、 Cadherin、 WD40、LIC、COG1100、PDZ_signaling、 COG5048、 PTZ00018、 DUF3512通路，其中7tm_1、 FN3及Cadherin通路是突變位點富集較多的通路(圖2B)。

A：單個PDAC腫瘤組織樣本中體細胞突變百分比排名前10位的基因突變分析；B：信號通路分析中相關基因的突變情況，紅色的圓點為生物學信號通路，對應X軸為該信號通路中出現的基因突變數量，對應的Y軸以及圓點的大小為與該信號通路有關的基因數量，圓點越靠右上方表示基因突變位點的數量和基因數量越多

本研究結果顯示，在PDAC中不同基因之間存在著基因互斥性和共現性的現象，如BMS1基因可以與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B、MAP1B、CDC27基因發生共突變，CDC27基因可以與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B以及MAP1B基因發生共突變；MAP1B基因可與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B基因發生共突變(圖3A)。相反的，某些基因突變間存在互斥性的現象，如RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B以及BDR9存在突變互斥。由于基因KRAS和RLIM突變研究的結果較多，本研究主要對TTN基因突變位點以及氨基酸方面的改變進行研究，TTN基因突變位點共有10處，其中在3例樣本當中發現了6處突變位點，均為C>T點的突變(c.53359C>T、c.53734C>T、c.53935C>T、c.72850C>T、c.75631C>T、c.80554C>T)，在氨基酸層面上均為精氨酸到半胱氨酸(R>C)的改變(p.R17787C、p.R17912C、p.R17979C、p.R24284C、p.R25211C、p.R26852C)，進一步結合患者的臨床特征，顯示這3例樣本均來自于低分化組亞組。TTN基因的全部突變點如圖3B所示，突變熱點聚集在lg_Semaphorin_C、lg_Titin_like結構域，而且僅發現1個同義突變，其余均為錯義突變。

A：基因共突變和互斥突變的分布圖；B：TTN基因上的突變位點，Y軸表示每個位點的突變頻次

2.4 PDAC腫瘤組織樣本中基因突變與患者臨床特征的關系

本研究結果顯示，不同腫瘤分化程度的患者ASTN1基因突變情況比較差異有顯著意義(χ2=6.855,P<0.05)；不同腫瘤分期患者TTN基因突變情況比較差異有顯著性(χ2=5.183，P<0.05)。見表1。

表1 PDAC腫瘤組織樣本中ASTN1、TTN基因突變與患者臨床特征的關系

3 討 論

目前，胰腺腫瘤性病變中體細胞突變與患者臨床特征間關系的研究已有報道，但該研究僅局限于50個胰腺癌相關的基因[7]。以往研究結果顯示，胰腺癌組織中存在多種致癌體細胞的突變，這些突變會影響關鍵致癌驅動基因以及腫瘤抑制基因，包括KRAS、TP53、CDKN2A以及SMAD4基因等，而目前尚不清楚哪些突變是導致腫瘤細胞轉移的突變[8-9]。因此，利用全外顯子測序結果分析胰腺癌體細胞突變和臨床特征之間的關系是必要的，從而前瞻性地指導患者的治療[10]。

通常，病理醫生判斷腫瘤患者的某一突變為體系突變還是胚系突變時，需要同一患者來源的腫瘤與非腫瘤組織的NGS測序數據。在多種腫瘤的體細胞突變研究中多使用配對組織分析方法，其中TCGA為常見的泛腫瘤數據庫，包含了多種類型的腫瘤與瘤旁樣本的測序數據[11]。然而，在臨床及實驗室實踐中有時難以獲取配對的瘤旁樣本，特別是在回顧性研究中，通常會缺乏與石蠟包埋的腫瘤樣本配對的非腫瘤樣本，因此僅應用腫瘤樣本分析體細胞突變的研究目前比較多[12-17]。

本研究采用的是全外顯子測序的方法，通過與COSMIC數據庫中的SNP進行比對用以鑒別入組的PDAC樣本中致癌體細胞的突變情況，結果在40例PDAC腫瘤組織樣本的759個基因中，總共檢測出1 446個致癌體細胞突變位點，每例樣本中發現有25～82個致癌體細胞突變位點，與之前所發表的PDAC腫瘤組織中平均有48個致癌體細胞突變位點的結論相符合[18]。眾所周知，KRAS基因的致癌突變是PDAC發展的主要驅動因素，本研究結果也表明KRAS基因體細胞突變發生頻率最高。這些結果與以往的研究報道一致，驗證了本研究方法對腫瘤樣本分析的有效性[19-20]。

本研究結果顯示，PDAC腫瘤組織中的RLIM、TTN和BRD9基因突變發生的百分比僅次于KRAS基因，表明這些基因在PDAC的發生發展中起著重要作用[21]。RLIM/RNF12基因編碼一種含RING域的E3泛素連接酶，通過負調控c-Myc轉錄活性來抑制細胞增殖，并通過消除MDM2介導的P53降解和泛素化來穩定TP53蛋白[22]。此外，RLIM蛋白已被證實在乳腺癌發生過程中調節雌激素依賴性轉錄和雌激素受體的生物活性，也有研究表明RLIM可通過誘導P15和P21蛋白而抑制肝細胞癌變[23]。這些研究成果為RLIM基因在癌癥生物學中的關鍵作用提供了更多證據，但目前針對RLIM基因與PDAC的報道較少。編碼titin蛋白的TTN基因在脊椎動物橫紋肌正常生理功能中具有重要作用，而在原發性胰腺癌和PDAC中TTN基因均有頻繁突變[24-25]。IZUMI等[15]對一組纖維肌病患者進行了連鎖分析以及外顯子組測序，發現c.90263G>T(NM_001256850)為一新的TTN基因突變。MIHAILOV等[16]分析了3例腹股溝疝患者的家族成員的全外顯子測序結果，發現了一個新的TTN基因c.88880A>C雜合錯義突變。這些都表明，TTN基因在多種疾病的發生發展過程中均發揮重要作用。同時，在胰腺神經內分泌腫瘤組織中BRD9基因突變檢出百分比較高，該基因編碼含溴結構域蛋白9的表達，是SWI/SNF染色質重塑復合體的一個組成蛋白[26]。本研究通過對PDAC腫瘤組織相關信號通路基因的突變分析，發現3個與PDAC相關的重要信號通路。此外，本研究分析了基因突變的互斥性和共現性，確定基因之間潛在的相互作用，可以更好地指導臨床靶向、化療和免疫治療等。

腫瘤組織中已存在的某個驅動基因突變會影響其他驅動基因的突變，這種現象被稱為驅動基因的互斥性。與互斥模式相反,驅動基因間也會存在協同模式,兩個協同的驅動突變往往同時發生,共同促進腫瘤的發展，這種現象被稱為共突變。在進行突變分析時確定腫瘤組織中基因突變潛在的相互作用，可以更好地了解腫瘤發生發展的機制，從而更好地指導臨床用藥。本研究結果表明，PDAC腫瘤組織樣本中BMS1、CDC27、MAP1B基因共突變的可能性較高，即如果樣本中BMS1基因發生突變，則CDC27和MAP1B基因也極可能發生突變。相反的，某些基因突變間存在互斥，例如RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9存在突變互斥，即在一個樣本中如果發生RLIM基因突變，則OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9基因幾乎不會發生突變。

本研究結果亦顯示，在PDAC患者Ⅲ/Ⅳ期組中TTN基因突變顯著富集，提示TTN與高分期PDAC密切相關[27-28]。但是，TTN基因突變與腫瘤的分化程度之間沒有關系，提示晚期富集突變不是由腫瘤分化程度所引起。遺憾的是，TCGA數據庫中與本研究中Ⅲ/Ⅳ期患者對應的樣本的數量太少，無法驗證富集程度，因此本研究沒有進行進一步的分析。本研究結果同時顯示，ASTN1基因突變與腫瘤的分化程度有關，而與腫瘤分期無關。同時，KRAS、TP53、SMAD4及CDKN2A基因突變與所分析的臨床特征沒有明顯的關系，與先前研究報道結果一致[29-30]。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究使用的應用COSMIC數據庫中的變異SNP擬合方法鑒定腫瘤組織中致癌體細胞突變，雖可以有效識別體細胞突變，但缺少匹配的非腫瘤樣本，致使通過全基因組關聯分析鑒定PDAC體細胞突變缺乏全面性；其次收集的腫瘤樣本量較少。綜上所述，本研究揭示了PDAC中體細胞突變與患者臨床特征之間的關系，發現了胰腺癌組織中KRAS、RLIM、TNN等基因突變頻率高，進而發現了與高頻突變基因相關的信號通路FN3。另外，本研究表明BMS1、CDC27、MAP1B基因共突變概率較高，而RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9基因存在突變互斥現象。最后本研究還闡明了TTN和ASTN1基因突變與腫瘤分化程度以及腫瘤分期的關系，為PDAC患者的精準治療提供了一定的理論參考依據。