冠心病患者外周血ATG-5、ATG-7水平與冠狀動脈病變程度、心率變異性及斑塊易損性的關系

李巍 李彥明

(河南大學淮河醫院，河南 開封 475000 1 心內科； 2 心電圖科)

脂質沉積、炎癥反應、氧化應激等都是引起冠心病的重要因素[1]，而巨噬細胞在其中扮演著十分關鍵的角色，通過攝取大量氧化型低密度脂蛋白并向泡沫細胞轉化，釋放大量炎性遞質和相關酶類參與動脈斑塊的形成[2]。研究顯示，巨噬細胞自噬在抑制斑塊早期形成、維持斑塊后期穩定等方面具有雙重保護作用[3]。自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種程序化降解機制，上調自噬相關基因5(ATG-5)蛋白的表達后，巨噬細胞通過自噬降解胞內膽固醇等的能力大大提高，有利于阻止巨噬細胞泡沫化的發生[4]。除了ATG-5以外，ATG-7也是激活巨噬細胞自噬的核心蛋白，可與ATG-5形成復合物，一方面參與自噬體的形成，另一方面促使微管相關蛋白1輕鏈3(LC-3)轉化為成熟的自噬體膜蛋白[5]。因此血清中ATG-5和ATG-7水平是反映細胞自噬功能的關鍵指標[6]。本研究通過探討血清自噬相關因子ATG-5、ATG-7與冠心病患者冠狀動脈病變嚴重程度、心率變異性(HRV)以及斑塊易損性的關系，為尋找有臨床應用價值的分子靶點提供新的思路和試驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月—2019年6月因不明原因胸痛在我院心血管內科進行冠狀動脈造影(CAG)檢查的患者248例，男134例，女114例；年齡33～85歲，平均年齡(64.93±12.34)歲。患者符合冠心病的診斷標準[7]。將所有患者分為冠心病組(左冠狀動脈的左前降支、右回旋支、右冠狀動脈及其主要分支中至少有1支血管腔狹窄程度≥50%)200例和對照組(CAG檢查未發現異常)48例。其中冠心病組又分為穩定型心絞痛組(SAP組)125例和急性冠狀動脈綜合征組(ACS組)75例。根據Gensini評分系統[8]，將冠心病組患者分為輕度病變(Gensini評分0～30)組94例，中度病變(Gensini評分31～60)組59例，重度病變(Gensini評分>60)組47例。所有受檢對象均排除腦血管疾病、急(慢)性感染、器質性心臟病、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、神經退行性疾病、代謝系統疾病以及長期大量吸煙、飲酒和濫用藥物等。本研究獲我院倫理委員會審查通過，且所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血清中ATG-5、ATG-7水平檢測 采集受試者空腹肘靜脈血，ELISA法檢測血清中ATG-5和ATG-7水平。試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2.2外周血單個核細胞的提取與ATG-5、ATG-7蛋白的檢測 采集每位受試者的動脈血15 mL，采用密度梯度離心法分離單個核細胞，然后收集于離心管中，加入RIPA細胞裂解液，提取總蛋白。采用Western blot法檢測單個核細胞中ATG-5、ATG-7蛋白的表達水平。ATG-5、ATG-7抗體購自北京中杉金橋生物科技有限公司，按照1∶100比例稀釋。

1.2.3HRV指標的檢測 冠心病患者采用12導動態心電圖儀(TLC5000型，德國CONTEC公司)進行24 h動態心電圖檢查，包括時閾參數：全部R-R間期的標準差(SDNN)、正常相鄰每5 min R-R間期均數標準差(SDANN)、正常相鄰R-R間期的均方根值(RMSSD)、正常相鄰間期差值>50 ms的心搏數占總心搏數的百分比(pNN50)；頻域參數為0.14～0.30 Hz低頻(LF)以及0.15～0.40 Hz高頻(HF)，并計算LF/HF比值。

1.3 血管內超聲檢查

采用血管內超聲儀(美國Boston Scientific公司)探查冠心病患者斑塊遠端、近端圖像，板塊類型分為脂質性斑塊(低回聲或無回聲)、纖維性斑塊(回聲強度與外膜組織相似)、鈣化性斑塊(強回聲，伴有斑塊后方聲影)、混合性斑塊(綜合上述多種回聲特征)。若血管腔內出現呈層狀、葉狀或閃亮的斑點狀低回聲圖像則判斷為血栓。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 冠心病組和對照組血清中ATG-5、ATG-7水平比較

冠心病組患者血清中ATG-5和ATG-7水平顯著高于對照組，差異有顯著性(Z=17.154、25.845，P<0.05)。見表1。

表1 兩組受試對象血清中ATG-5、ATG-7水平比較[ρ/μg·L-1，M(P25，P75)]

2.2 不同冠狀動脈病變程度冠心病患者HRV指標及血清中ATG-5、ATG-7表達的比較

輕度、中度以及重度組患者SDNN、SDANN、RMSSD、pNN50、LF/HF及血清中ATG-5和ATG-7水平比較，差異均具有顯著意義(F/Z=13.261～363.795,P<0.05)。且病變程度越嚴重，SDNN、SDANN、pNN50以及LF/HF比值越低，同時血清中ATG-5和ATG-7水平越高。見表2。

2.3 冠心病患者HRV指標與血清中ATG-5和ATG-7表達的相關性

Pearson相關性分析顯示，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平與SDNN、SDANN、pNN50值呈負相關性(r=-0.489～-0.172，P<0.05)。另外血清中ATG-7水平與RMSSD值也呈負相關性(r=-0.212，P<0.05)。

2.4 SAP組和ACS組患者外周血血清和單個核細胞中ATG-5、ATG-7水平比較

ACS組患者血清中ATG-5以及ATG-7水平明顯高于SAP組患者(Z=11.089～33.127，P<0.05)。ACS組患者單個核細胞中ATG-5和ATG-7水平均明顯低于SAP組患者(t=10.598、15.351，P<0.05)。見表3。

2.5 SAP組患者和ACS組患者血管內超聲檢查結果比較

經血管內超聲檢查，SAP組患者主要以纖維性斑塊為主，而ACS組患者則以脂質性斑塊為主，兩組患者纖維性斑塊、脂質性斑塊類型比例比較，差異具有顯著意義(χ2=18.949、28.020，P<0.05)。另外ACS組斑塊破裂患者的比例明顯高于SAP組，差異有顯著統計學意義(χ2=18.049，P<0.05)。見表4。

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎，其中巨噬細胞轉化為泡沫細胞是病變斑塊形成的關鍵環節[9-11]。因此減少易損斑塊中巨噬細胞的浸潤，增加斑塊的穩定性也是目前臨床上治療冠心病的重要目的之一[12]。眾多研究證實，自噬在心血管疾病發生、發展過程中的作用不可忽視[13-15]。自噬是真核細胞中普遍存在的一種維持細胞穩態和代謝平衡的重要過程，其發生機制復雜，目前尚未完全解碼細胞自噬的整個過程，因此關于自噬與心血管疾病的關系一直停留在臨床前研究階段，尚未有可靠的研究成果應用于臨床。本研究希望能為自噬相關分子應用于臨床提供新的思路。

自噬分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，其中以大自噬研究最為成熟[16]。在病理條件下，一些細胞因子可誘導血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等啟動自噬過程[17]。當低密度脂蛋白通過受體及非受體途徑進入內皮下后發生氧化，長期暴露于氧化低密度脂蛋白環境中的血管內皮細胞自噬明顯增加，同時激活巨噬細胞形成泡沫細胞，加重壞死物質的產生及繼發性炎癥反應[18-19]。本研究中冠心病組患者血清中自噬相關因子ATG-5以及ATG-7水平高于對照組，并且隨著冠狀動脈病變嚴重程度的加重，患者血清中ATG-5以及ATG-7水平也隨之增高。

除了根據Gensini評分評估冠狀動脈病變程度以外，HRV也是定量評估心肌功能和狀態的重要指標[20]，主要用于反應自主神經系統對心功能的調節能力以及交感神經與迷走神經的平衡性。相較于CAG檢查，HRV檢查具有無創、成本低等優勢，更適用于冠心病早期評估[21]。本研究結果顯示，冠心病患者HRV指標與冠狀動脈嚴重程度和Gensini評分均有密切相關性，Pearson相關性分析顯示，冠心病患者血清中ATG-5以及ATG-7的水平與SDNN、SDANN、pNN50值呈負關，與Gensini評分呈正相關。另外血清ATG-7水平與RMSSD值也呈負相關。說明HRV在一定程度上可反應患者冠狀動脈病變程度。而且血清中ATG-5、ATG-7水平與心率變異性存在一定的關聯，說明自噬貫穿于冠心病發生、發展的整個過程，但是在各個階段發揮的作用和具體機制尚需進一步研究。

表2 不同冠狀動脈病變程度患者HRV指標、血清中ATG-5和ATG-7水平比較

表3 SAP組和ACS組患者外周血血清和單個核細胞中ATG-5、ATG-7水平比較(ρ/μg·L-1)

表4 SAP組和ACS組患者冠狀動脈病變狹窄處斑塊類型比較(例(χ/%))

另外本研究結果亦顯示出，ACS組患者血清中ATG-5、ATG-7水平明顯高于SAP組，但是單個核細胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達水平卻低于SAP組。這可能是由于ACS以不穩定性斑塊為主，當血管內皮受損后，內皮細胞的自噬性死亡易于發生斑塊破裂及血栓形成。過度的平滑肌自噬也會導致平滑肌細胞的自噬性死亡，斑塊中膠原纖維合成減少，從而導致纖維帽變薄，最終增加斑塊的不穩定，因而血清中由內皮細胞和血管平滑肌細胞分泌的ATG-5、ATG-7蛋白分子明顯增加[22]。但是巨噬細胞自噬不足可導致膽固醇流出減少，脂質過載的泡沫細胞大量凋亡并難以清除，斑塊中脂質含量顯著增加，進而加重動脈粥樣硬化斑塊的不穩定[23]，因此ACS組患者單個核細胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達量明顯降低。

綜上所述，自噬在冠心病發生、發展過程中具有兩面性，一方面可通過參與血管內皮損傷、調節血管平滑肌細胞表型轉化等促進冠狀動脈病變的加重，同時還可以通過抑制單個核細胞泡沫細胞的形成增加斑塊的穩定性。本研究也從自噬角度提示血清中ATG-5、ATG-7在冠心病發生、發展過程中都扮演著重要角色，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平越高，病變程度越嚴重，HRV越低；另外，雖然ACS組患者血清中ATG-5、ATG-7水平高于SAP組患者，但是單個核細胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達卻低于SAP組患者，說明在冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平與冠狀動脈病變程度以及HRV有一定關聯；而單個核細胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達降低可能是降低ACS患者斑塊穩定性的重要機制。因此增加單個核細胞自噬對于穩定易損斑塊可能有一定的作用，但是由于自噬作用機制十分復雜，還需進行更進一步的研究加以探討。