不同處理方法制作的脂肪組織切片質量比較

劉小玲 張偉 趙潔

(1 中國人民解放軍海軍第971醫院病理科，山東 青島 266071； 2 青島大學數字醫學與計算機輔助手術研究院)

日常外科手術標本中有許多是含有脂肪組織的標本，在病理組織切片制作過程中，處理好脂肪組織，將會極大地提高切片質量，有利于疾病的正確診斷。但因脂肪組織內含有大量不溶于水的脂質[1]，這一特性使其在傳統切片制作過程中很難完全置換出來，從而易產生組織破碎、積壓、空洞、缺損等問題，嚴重影響切片質量，給醫師診斷帶來很大困難。而如果單獨對脂肪組織額外進行脫水、透明、浸蠟等處理，則會增加切片處理的時間與成本。本研究通過對4種處理方法制作的脂肪組織切片的質量進行比較，探討較為可行的脂肪組織切片制作方法。

1 材料與方法

1.1 標本與來源

收集2019年中國人民解放軍海軍第971醫院病理科明確診斷的脂肪瘤組織、乳腺脂肪組織和胃、腸、子宮或腎臟器官根治切除術中的脂肪組織標本共298例。

1.2 儀器與試劑

ASP300S脫水機、EG1160包埋機(德國徠卡公司)以及HM315R切片機(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.3 方法

標本均于離體2 h以內經體積分數0.04甲醛溶液固定24 h后[2]，并按照文獻[3]的方法切成約2.0 cm×1.0 cm×0.1 cm大小的組織塊4塊，分為傳統處理法組(A組)、延長浸蠟法組(B組)、丙酮脫脂法組(C組)和改良組織脫水處理流程法組(D組)4組。A組標本置于ASP300S全自動脫水機中進行脫水、透明、浸蠟處理，首先采用體積分數0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00、1.00乙醇溶液分別脫水90、90、60、60、60、45、45 min；其次采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液分別透明30、30 min；最后采用石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ溶液分別浸蠟60、60、60 min。B組將標本首先按照A組方法進行處理后，浸蠟時間再延長8 h[4-5]。C組標本在脫水處理之前，先置于丙酮液中于封閉的振蕩器中處理4 h，之后再按照A組方法進行處理[6-8]。D組標本在進行脫水處理過程中，脫水的試劑及作用時間更改為體積分數0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液和體積分數1.00乙醇溶液與二甲苯(1∶1)混合液分別處理90、90、120、60、60、45和90 min[9]，后續的透明和浸蠟處理同A組。

將上述4組標本進行石蠟包埋后，采用輪轉式切片機進行4 μm厚切片，然后40～42 ℃下于攤片機中攤片，70 ℃下烤片15 min[2]，最后進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，置于光學顯微鏡下觀察。以臨床技術操作規范切片質量分級標準對切片的質量進行評估[10]。

2 結 果

光學顯微鏡下觀察顯示，A組切片的優良率為40.9%(122/298)，切片存在破碎嚴重、脂肪細胞破裂、細胞核和細胞質對比不鮮明等問題(圖1A)；B組切片優良率為43.0%(128/298)，切片的質量與A組相近(圖1B)；C組和D組切片優良率分別為98.7%(294/298)和99.0%(295/298)，切片厚薄均勻、平整、無皺褶、無刀痕，且脂肪細胞結構完整，染色清晰，透明度好(圖1C、D)。4組切片的優良率比較差異具有顯著性(χ2=462.827，P<0.001)；C組與D組切片的優良率均顯著高于A組與B組(χ2=223.666～238.973，P<0.001)；而A組與B組之間、C組與D組之間切片的優良率比較差異均無顯著統計學意義(P>0.05)。

A～D分別為A組、B組、C組和D組，HE染色，10倍

3 討 論

臨床病理工作中常見脂肪組織標本，在切片制作過程中，處理好脂肪組織對提高切片質量和疾病正確診斷率具有重要意義。在脂肪組織切片傳統處理流程中，對脂肪組織發揮脫脂作用的主要是高濃度的乙醇溶液[11]。但是乙醇溶液脫脂速度比較緩慢[12-13]，一般需要12 h以上才能脫脂完全[14]，但高濃度乙醇溶液實際處理的時間僅有4.5 h，只能置換出極少量脂肪組織；同時脂肪組織不溶于水，高濃度乙醇溶液不能置換出脂肪內的水分，也會影響脫水效果[15]。組織在脫水不徹底的情況下再采用二甲苯進行透明處理時，透明效果不佳[15]。在浸蠟處理過程中也不利于組織與石蠟之間的相互滲透[15]，最終造成制片困難。因此，以傳統方法處理的脂肪組織標本，經脫水、透明和浸蠟處理后再進行切片時易出現破碎、散片現象，鏡下觀察時也會出現組織結構不清、細胞斷裂的問題，從而影響對疾病的診斷[16]。

研究顯示延長浸蠟法制作的切片完整性與傳統方法相近[4]。但由于傳統處理方法未能對標本中的脂肪組織完全溶解，致后期浸蠟效率降低，最后脂肪細胞呈現空泡狀[4]，通過再增加8 h的浸蠟時間，以石蠟來支撐和填充空泡狀的脂肪細胞，以達到保持其正常形態的效果[4]。

本研究中C組切片優良率較A組顯著增高。丙酮有快速脫脂功能[5-7]，并可溶于水、醇、氯仿等試劑中，因此在脂肪組織脫水前先進行脫脂處理，提高了切片的質量。需要注意的是，丙酮脫脂法制作的切片質量好壞，主要取決于標本是否固定充分[17]。如果固定不充分就進行脫脂處理，則會導致脂肪組織變脆，切片時出現脂肪空泡破碎、攤片散片等現象，致使制片失敗。

但在近期的大量研究中又發現，乙醇溶液只能使脂肪組織逐步滲透脫水，真正溶解脂肪組織的試劑是二甲苯[9]，因此有學者又提出改良脫水處理法[9]，即脂肪組織在脫水處理之后和透明處理之前，先以乙醇和二甲苯(1∶1)混合液進行處理。由于二甲苯不溶于水，所以將其置于脫水處理之后；同時二甲苯令脫水后的脂肪迅速溶解，從而促進了體積分數1.00乙醇溶液的滲透；體積分數1.00乙醇與二甲苯溶液協同交替作用，達到邊脫水，邊溶脂的功效。此種方法使得脂肪或有脂肪包裹的組織得到充分脫水與透明，亦保證了石蠟的有效浸透，使切片的完整性得到明顯提高[9]，從而得到效果比較滿意的切片。

本研究在此改良脫水處理的基礎上，結合臨床工作實踐，對脫水處理流程又進行了調整。首先將體積分數1.00乙醇和二甲苯(1∶1)混合液由原來的45 和60 min兩次處理更改為該混合液的一次處理90 min[9]，時間縮短了15 min；同時又增加了一次體積分數1.00乙醇和一次二甲苯的處理[18]，結果顯示脫脂效果更好，切片優良率達到99.0%。

綜上所述，丙酮脫脂法與改良脫水處理流程法制作切片優良率高于傳統處理法和延長浸蠟法，易于疾病的病理診斷；但丙酮脫脂法試劑準備較為繁瑣，而改良脫水處理流程法無需額外試劑準備，更省時省力，是一種非常實用的脂肪組織處理方法，值得在各醫院推廣、使用。