基于UPLC-Q-orbitrap-MS的非靶向代謝組學用于不同橄欖品種差異代謝物分析

唐雪妹 趙曉麗 高毓文 葉倩 朱富偉 蘇連水 萬凱

摘 ?要：橄欖含有豐富的生物活性物質，這些成分的含量與橄欖品種、加工過程及儲存條件等密切相關。分析我國烏橄欖和青橄欖2個主栽橄欖品種，利用液相色譜-高分辨質譜（UPLC-Q-orbitrap-MS）結合統計學模型進行綜合評價。結果表明：利用非靶向代謝物分析流程篩選鑒定出47種顯著性差異代謝物，其中氨基酸9種，黃酮多酚類20種，油脂類8種，有機酸類3種，香豆素類化合物2種，其他5種。烏橄欖中含量較高的物質有山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、羅漢松脂素、高車前苷、楊梅素、花旗松素、1-棕櫚酰-2-月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿PLPC、桐油酸、甘草次酸，青橄欖中含量較高的物質有鞣花酸、短葉蘇木酚酸、沒食子酸及相應的葡萄糖苷，這些物質在2個品種中的平均含量比率超過30倍以上。這表明不同橄欖品種內源性代謝物存在明顯差異且各具特色，為今后橄欖品質評價、資源合理利用及不同產品的深度開發提供數據支撐。

關鍵詞：UPLC-Q-orbitrap-MS;非靶向;橄欖;代謝物

中圖分類號：S59 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Olives （Olea europaea L.） are rich in biologically active substances， and the content of the components is closely related to olive varieties， processing and storage conditions. The chemical constituents of table olive were ana-lyzed by UltraHigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometry （UPLC-Q-orbitrap- MS） combined with statistical analysis. A total of 47 significantly different metabolites were identified from the chro-matograms of 2 olive varieties. The compounds included 9 kinds of amino acids， 20 kinds of flavonoids and poly-phenols， 8 kinds of lipids， 3 kinds of organic acids， 2 kinds of coumarin compounds， and 5 kinds of other compounds. Juglalin， matairesinol， plantagoside， myricetin， taxifolin， PLPC， α-eleostearic acid and 18-β-glycyrrhetinic acid showed the highest values in Canarium pimela Koening. Ellagic acid， brervifolincaboxylic acid， gallic acid and its corresponding glucosides showed the highest values in Canarium album. The average content ratio of the substances in the two varie-ties is more than 30 times. The results showed that there were significant differences in the endogenous metabolites among different olive varieties and each had its own characteristics， which would provide data support for the future olive quality evaluation， rational utilization of olive resources and in-depth development of different olive products.

Keywords： UPLC-Q-orbitrap-MS; untargeted; olive; metabolomics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.006

橄欖是一種重要的經濟作物，廣泛分布于地中海國家以及我國南部。從橄欖果中產生的橄欖油具有較高的營養價值，在人類飲食中發揮重要角色。同時，橄欖也可作鮮食和加工成涼果，是著名的亞熱帶特色水果[1]。新鮮成熟的橄欖果肉含有豐富的生物活性物質，如多酚、黃酮、Vc、蛋白質及微量元素等，從而使橄欖具有抗氧化、抗心血管疾病、抗癌、抗炎癥等生物功效[2-4]。橄欖產品生物活性物質含量與橄欖品種、成熟程度、工業發酵過程以及儲存條件等密切相關。因此，開發一種新的有效方法來分析判別橄欖品種代謝組分的差異，找到其代謝標志物，對于橄欖油的真偽鑒別及促進橄欖鮮果的高效加工利用具有重要意義。

橄欖品種雖繁多，但良莠不齊，缺乏科學的開發利用依據，嚴重阻礙橄欖產業的健康發展。橄欖品種間有機酸、蛋白質、Vc、可溶性固形物和礦質元素等營養成分及含量的差異，在一定程度上反映了橄欖品種的遺傳差異，對橄欖鮮食品種、鮮食配套品種以及加工品種的確定也具有現實意義[5-6]。大量的研究結果表明，不同橄欖品種品質和口感差異與其內在代謝物的種類和含量密切相關。何志勇等[7]提出橄欖果實多酚類物質如黃酮、單寧等含量是影響果實鮮食的主要因素;趙金星等[8]研究發現橄欖果實風味的形成與糖酸等物質關系小，與酚類物質關系密切。近幾年，采用色譜質譜技術對鮮食橄欖特征生物活性成分的研究得到了越來越多的關注，尤其是內源性代謝物如多酚物質、氣味芳香物質的挖掘[9-11]。然而，從代謝組學層面深入研究橄欖品質特征，以及不同品種橄欖果實代謝物差異成分比較等研究比較缺乏，不利于橄欖資源合理利用及橄欖不同產品的深度開發。

青橄欖和烏橄欖是我國南方特有的藥食兩用水果，與國外的油橄欖差別甚大，是加工型水果，果肉除生吃亦可腌制和藥用。本研究主要利用UPLC-Q-orbitrap-MS結合多變量統計學分析，對我國主要的2類橄欖的化學成分差異進行對比分析，尋找品種間的生物標志物。采用非靶向代謝組學策略，可有效地幫助科研人員更好地分析復雜體系的化學組成，挖掘更多有用的信息，探明不同橄欖品種成分的顯著性差異，為橄欖果實有效加工和利用提供參考依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究于2018年11—12月在廣東省橄欖主產區采集25個鮮食橄欖樣品，其中廣州增城采集10個烏橄欖，潮州普寧采集14個青橄欖和1個烏橄欖（表1）。每個樣本均采摘于果實成熟期，由人工隨機采摘的200個成熟個體混勻組成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品提取 ?新鮮橄欖采摘后，果實表面用去離子水洗凈、晾干，將果肉和果核分開，棄去果核部分。取適量果肉置于勻漿機中研磨搗碎至粉末狀，于–80 ℃冰箱保存。準確稱量2 g橄欖樣于離心管中，加入80%甲醇水溶液10 mL，渦旋混勻，室溫條件下超聲萃取30 min;8000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清。殘渣再加10 mL甲醇重復提取2次，合并上清液。上清液部分旋轉濃縮近干，用80%甲醇水溶液定容至1 mL，過0.22 μm PTFE濾膜，于–20 ℃保存待用。

1.2.2 ?UPLC-Q-orbitrap-MS分析 ?采用賽默飛Q-Exactive液質聯用儀，使用Tracefinder軟件實現儀器控制、數據采集及數據分析。色譜柱使用C18 Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱，0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）作為流動相，流速設置0.3 mL/min。色譜分離條件為：0～2 min，10% B;2～12 min，10%～80% B;12～15 min，80% B;15～ 18 min，80%～10% B;保持10% B平衡2 min，整個分析時間為20 min。柱溫35 ℃，進樣體積5 μL。

質譜分析條件：離子源參數，使用ESI電離源在正負離子切換模式下進行質譜數據采集，噴霧電壓4 kV（正離子模式），3.5 kV（負離子模式）;鞘氣（N2>95%）為40 bar;輔助氣體（N2>95%）為10 bar;加熱器溫度300 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。一級掃描模式MS Full Scanning mode，質荷比（m/z）為100～1000，分辨率為70 000。二級質譜掃描模式采用數據依賴采集（dd-MS2），分辨率為17 500。高能碰撞解離（HCD）的能量設置為階梯模式（20、40、60 eV）

1.2.3 ?質量控制 ?從每個樣品提取液中取相同體積樣品混合組成質控樣（QC），用于數據的穩定性和重復性評估。在UPLC-Q-orbitrap-MS分析過程中，每5個樣品中插入1個質控樣，用于監測方法的穩定性和數據的可靠性。

1.3 ?數據處理

液質采集的原始數據文件直接導入compound discover軟件分析，經過峰檢測、提取、去卷積、歸一化、峰對齊等處理后，生成包含質荷比、保留時間、峰面積的代謝物數據集，該數據集可進一步用于統計學分析。前處理得到數據集用SIMCA-P軟件進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。PCA得分圖可清楚的區分不同種類和不同地區的樣品，采用OPSL-DA模型比較2個不同樣品，從而實現特征生物標志的挖掘。

2 ?結果與分析

目前，考慮樣品的化學復雜性，為了獲得更為完整的信息，代謝組學策略已經由單獨目標物或者已知一類物質的檢測向全面信息檢測轉變。本研究采用非靶向代謝組學研究不同品種橄欖化學成分差異，具體分析流程如圖1所示，首先采用UPLC-Q-orbitrap-MS采集橄欖樣品的植物化學指紋圖譜，獲得樣品數據集，再利用PCA統計學模型對不同類型橄欖進行初步聚類分析，隨后OPLS-DA及變量選擇方法變量權重值（VIP）、S圖（S-plot）等篩選出不同品種橄欖的特征化合物，從而實現不同品種樣品間差異化學成分分析和鑒定。

2.1 ?橄欖指紋圖譜

為了從橄欖樣品中萃取更多有效成分，從而獲得樣品的全面信息，需要選擇合適的分析條件包括提取方法和質譜分析方法。根據文獻調研，在大部分植物代謝物研究中，均采用水和甲醇作為萃取溶劑，超聲輔助萃取可有效提高萃取效率[12]，因此本研究采用超聲萃取的提取方法，同時，考察3種溶劑100%甲醇、70%甲醇和純水的提取效果。結果表明，70%甲醇可提取出更多的代謝物成分，萃取效果優于100%甲醇和純水。甲醇具有較高的極性，溶解性好，可萃取大部分極性代謝物。此外，橄欖是果實含水量較少的水果，一定含水量的甲醇提取溶液可同時有效提取脂溶性代謝物和水溶性代謝物，因此，本研究選擇70%甲醇，超聲輔助萃取作為橄欖樣品的最優提取方法。

使用UPLC-Q-orbitrap-MS系統在最優的流動相組成和洗脫梯度下對不同品種的橄欖果肉甲醇提取物進行分析，得到橄欖樣品的代謝輪廓指紋圖譜。如圖2所示，負離子模式下，2種不同橄欖的代謝成分存在明顯差異，如烏橄欖在2～12 min出現的峰對應的物質種類和相對含量與青橄欖明顯不同，12 min后仍可見多個特異性峰（圖2A）。同樣，正離子模式下，2種橄欖的代謝指紋圖譜差異明顯，烏橄欖在保留時間 7～8 min以及12 min后具有顯著差異性峰，青橄欖在1.77 min和8～9 min之間有特征峰出現（圖2B）。此研究結果為后續統計學分析差異性代謝物奠定基礎。

2.2 ?統計學分析及差異代謝物篩選

在最優的條件下分析所有的橄欖樣品，通過合適的參數設置，用compound discover自動提取到9586個代謝物。多變量統計學方法PCA已經被廣泛用于評估產品質量、追蹤產物起源、辨別劣質產品等過程的數據分析[13]。PCA的基本原理是使用數學程序將多個相關的變量轉變成少個不相關的變量，稱之為主成分（PCs）。本研究用SIMCA-P軟件對檢測到的橄欖數據進行PCA，主要以峰面積作為變量來觀察樣品直接的變化。圖3是30個樣品的PCA 得分圖和荷載圖。PCA得分圖可直觀地反映出不同品種橄欖樣品的差異。如圖3所示，在主成分1和主成分2的二維圖上， 30個樣品可清楚的分為幾個組，一個樣品出現在95%置信區間以外，可判斷為異常值，這個異常值可能是原材料差異或者保存過程中引起的變化。在PCA得分圖中可看到QC樣品均集中在中心位置，且分布緊密，說明本方法利用UPLC- Q-orbitrap-MS獲得數據具有很好的重現性和穩定性，數據可靠，可用于橄欖的代謝組學分析。此外，各品種樣品組內聚集在一起，不同品種樣品之間相距較遠，在空間上可明顯區分，聚類趨勢明顯，說明幾組樣品的代謝產物在種類、數量和濃度等方面存在差異。PCA得分圖可有效的展示異常值、組別及其他類型的研究樣品。

由非監督模式的PCA模型初步判斷樣品組別后，采用有監督模式的OPLS-DA分析數據，該模型可降低系統噪聲的干擾，提高分類效能。經7次循環交互驗證（7-fold cross-validation）得到的模型評價參數，本研究數據建立的OPLS-DA模型的R2Y為99.2%，R2Q均為96.6%，說明該模型具有較好的擬合性和預測性。圖4是建立OPLS-DA得分圖，青橄欖和烏橄欖在第一主成分軸上明顯分開，說明青橄欖的代謝成分明顯區別于烏橄欖。由此可知，不同品種對橄欖代謝物會產生一定的影響。通過OPLS-DA分析，代謝物和樣品之間的關系可用于品種辨別及產地溯源分析。

為找出青橄欖和烏橄欖品種間的潛在差異化學標志物，進行擴展統計分析得到S-plot圖（圖5A）。在S-plot圖中，每一個點代表著一個保留時間和質荷比組成的變量（t-m/z pair），X軸表示變量的貢獻，離零點越遠的變量，對兩組樣品區分貢獻越大。Y軸表示變量可信度，離零點越遠的變量，對樣品區分的置信水平越高。因此，處在“S”曲線兩端的離子，可作為區分不同品種橄欖的潛在化學標志物。此外，利用OPLS-DA模型得到的VIP來衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，挖掘具有生物學意義的差異代謝物。本研究選擇OPLS-DA統計分析VIP>1，|fold charge|>2以及students’t-test P<0.05的代謝物為具有顯著性差異的代謝物，共篩選出47個差異明顯的化合物，這些物質可借助高分辨質譜的優勢進行結構鑒定。

2.3 ?顯著性差異代謝物鑒定

在代謝組學中，未知化合物的鑒定是目前主要難點之一。本研究代謝物鑒定采用基于高分辨質譜的非靶向分析流程，即采用全掃描結合數據依賴二級質譜分析（full scan-ddms2），提取準確的質荷比、保留時間、同位素峰比及二級碎片離子，與內部數據庫及在線數據庫如massbank da-tabase （https：//massbank.eu/），human metabolome databases （HMDB， http：//www.hmdb.ca/），Metlin database （http：//metlin.scripps.edu）代謝譜圖庫進行對比檢索。同時，鑒定到的物質與文獻報道和標準品進行確認，初步預測和鑒定化學組成成分。以山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷為例，在樣品中通過準確分子量可提取目標化合物，確認該物質在每個樣本中的相對含量，二級碎片則可提供詳細的結構信息。m/z 419.09665預測組成為（C20H18O10+H）+離子，通過碰撞誘導解離，產生山奈酚特征峰287.0547 （C15H10O6+H）+，丟失132 Da （C5H8O4），因此，該化合物鑒定為山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，再通過與庫中標準物質二級碎片比對確認結構。

本研究鑒定的區分不同種類橄欖的重要代謝物及相關信息見表2，經過分析發現，青橄欖和烏橄欖2個品種中差異最明顯的代謝物主要為氨基酸、多酚類、黃酮類及脂質等。其中烏橄欖中含量較高的物質有山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、羅漢松脂素、高車前苷、楊梅素、花旗松素、1-棕櫚酰-2-月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿PLPC、桐油酸、甘草次酸，青橄欖中含量較高的物質有鞣花酸、短葉蘇木酚酸、沒食子酸及相應的葡萄糖苷，這些物質在2個品種中的平均含量比率超過30倍以上。由此可見，在烏橄欖中黃酮類化合物和油脂類化合物相對較豐富，在青橄欖中多酚類化合物含量更高。

3 ?討論

代謝組學技術在果實品質方面研究雖然起步較晚，但隨后發展迅速且應用非常廣泛[14]。本研究利用高分辨質譜結合多元統計分析，從非靶向代謝組學角度，對不同鮮食橄欖代謝差異成分進行分析。結果表明，橄欖果肉中含有豐富的氨基酸、油脂、生物堿、多酚、黃酮類物質，因此，鮮食橄欖具有獨特的苦澀味和諸多藥理作用，然而不同品種橄欖中代謝物的組成和含量差異顯著。多酚和黃酮類化合物有抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗心血管等功能[4， 15]，統計學分析結果顯示，青橄欖和烏橄欖品種間，差異最為明顯的物質集中在多酚和黃酮物質，這些物質在二者含量比率較大。其中奎尼酸、槲皮苷、鞣花酸在區分2個品種中的貢獻最大。氨基酸作為橄欖果實重要營養物質及風味組成成分，其比例和種類是作為評價植物品質優劣的主要指標之一。不同的氨基酸其風味不同，其中絲氨酸和谷氨酰胺為甜味氨基酸，谷氨酸和苯丙氨酸為鮮味氨基酸，氨基酸在2種橄欖中都較為豐富，但不同品種氨基酸含量有所差別，是造成二者鮮食口感差異的重要因素[16]。此外，研究發現烏橄欖明顯區別于青橄欖的獨特的芳香氣味是由對聚傘花素等烯萜類造成，而且烏橄欖油脂含量明顯高于青橄欖，更適合作為開發橄欖油等相關產品的基礎原料。因此，根據這些活性物質成分和含量開發相應保健產品，可大幅度提高橄欖功能性成分的生物利用度。

目前，對于橄欖代謝物研究多數采用靶向代謝組學技術，主要集中在特定一類化合物如多酚物質的研究上[9-12]，本研究采用非靶向代謝組學策略，無偏向性的檢測樣品內源性代謝物差異，由單獨目標物或者已知一類物質的檢測向全面信息檢測轉變，可獲得更多更豐富的代謝物信息。本研究利用高分辨質譜，可一次提取進樣同時篩查出氨基酸、多酚、黃酮、生物堿及油脂和芳香性氣味等，方法快速高效。非靶向代謝組學策略在背景知識有限的情況下，對樣品進行系統鑒定分析，獲取大量代謝物數據，對于尋找差異代謝物和生物標志物具有獨特優勢。

由于鮮食橄欖地域性消費較突出，而現有蜜餞產品開發工藝多數停留在初加工且對橄欖中生物活性成分破壞較大，造成藥用資源浪費。不同的加工過程會導致氧化和水解反應，從而使橄欖利用價值降低，因此，根據不同品種橄欖的代謝物差異從而選擇特定的加工過程，對于充分有效利用橄欖資源至關重要[17]。此外，不同的地理環境和生長氣候可能對橄欖化學成分比例產生重大影響，這些將直接影響橄欖的口感、風味和生物活性物質。本研究通過非靶向代謝組學分析不同產地和不同品種橄欖化學成分，為橄欖植物資源合理利用及相關產品深度開發提供試驗依據，從而提高橄欖產品的附加值，拓寬橄欖市場。

4 ?結論

橄欖作為一種特色藥食兩用農產品，在我國資源豐富，具有可觀的開發利用前景。本研究建立一種非靶向代謝組學分析方法用于不同品種橄欖的化學成分分析，利用統計學分析篩選出顯著差異代謝物并進行了初步鑒定。研究表明，橄欖樣品含有豐富生物活性物質，其中不同品種代謝物差異主要是酚酸類、黃酮類、氨基酸和脂質類化合物。目前，我國橄欖加工尚處于初步階段，如何科學合理地開發利用橄欖資源，研發豐富多樣的橄欖產品有待大量科技投入。本研究可為橄欖植物資源合理利用及相關產品深度開發提供依據。

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責任編輯：黃東杰