城市紅樹林系統中微塑料表面細菌群落結構特征分析

付茜茜 李大圳 章宇晴 鄧惠 馮丹 趙媛媛 俞花美 吳曉晨 葛成軍

摘 ?要：以城市紅樹林生態系統為研究對象，研究該系統水體中微塑料表面細菌群落結構的多樣性與組分特征。采用野外原位暴露實驗的方法，利用掃描電鏡顯微鏡（SEM）和16S rDNA高通量測序技術，檢測聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和具有可降解性的聚乳酸（PLA）4種不同類型微塑料表面形貌特征和細菌群落結構。結果表明：4種微塑料暴露45 d后（標記為LPE、LPS、LPVC、LPLA）在其表面均能觀察到明顯微生物聚集體，主要以桿狀細菌、球狀細菌為主;不同類型微塑料表面生物膜總量存在顯著差異，表現為LPE>LPLA>LPS>LPVC;4種微塑料表面的細菌群落主要包括變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），而水環境中以藍細菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢菌群。基于細菌群落多樣性分析，結果發現微塑料表面生物膜中的細菌群落結構和周圍水體存在顯著差異，各個類型的微塑料表面細菌群落結構組分相似。紅樹林系統是微塑料的重要收納場所，研究微塑料表面生物膜微生物群落特征，為進一步開展城市紅樹林系統中微塑料的環境行為與生態風險評價提供重要參考依據。

關鍵詞：紅樹林生態系統;微塑料;細菌群落結構;城市

中圖分類號：S718.55 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Recently， microplastic pollution has become a new global environmental problem. Due to the strong hydro-phobicity and large specific surface area， microplastics exposed to the environment can provide a new ecological site for microorganisms. Mangrove system is the “source” and “sink” of pollutants. Urban mangrove system was selected to study the diversity and composition characteristics of the bacterial community structure of the microplastics surface in the system. The method of in-situ exposure experiment， scanning electron microscope and 16S rDNA high-throughput sequencing technology were used to investigate the surface morphology characteristics and bacterial community structure of four types of microplastics （PE， PS， PVC， PLA）. The results showed that obvious microbial aggregates were observed on the surfaces of the four microplastics after exposure （labeled as LPE， LPS， LPVC， LPLA）， mainly bacilli and cocci （shape）. There were significant differences in the total amount of biofilm on the surfaces of the four microplastics， which was represented by LPE>LPLA>LPS>LPVC. The results of high-throughput sequencing presented that the bacterial communities on the surfaces of the four microplastics mainly included Proteobacteria and Bacteroidetes. However， in the water environment， Cyanobacteria_Chloroplast， Proteobacteria， Actinobacteria and Bacteroidetes were the dominant flora. Based on the analysis of the diversity of the bacterial community， it was found that there were significant differences between the bacterial community structure in the microplastic surface biofilm and the surrounding water body， and the bacterial community structure composition on the surfaces of the four microplastics were similar. Since microplastics were accumulated in the mangrove area， it is necessary to study the microbial community characteristics of microplastic surface biofilm in order to provide an important reference for in-depth understanding the environmental behavior and ecological risk assessment of microplastics in urban mangrove systems.

Keywords： mangrove system; microplastics; bacterial community structure; urban

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.041

微塑料（MPs）是指粒徑或長度小于5 mm的塑料，來源于大塊塑料垃圾的碎裂或其直接環境排放，包含碎片、纖維、顆粒、發泡、薄膜等不同形貌類型[1]。近幾年來，微塑料在全球各地海水、河流湖泊[2]、飲用水[1]、污水處理廠進水和出水[3]、沉積物[4]、土壤[5]和生物體[6]中被頻繁檢出，且豐度呈現出不斷增加的趨勢。2020年意大利學者甚至在人類胎盤中發現了直徑為5～10 μm的微塑料[7]。微塑料污染已成為當前新的全球性環境污染問題。

因具有疏水性強、比表面積大等特性，暴露于環境中的微塑料容易被微生物快速定殖，并在其表面形成微生物膜[8]。Li等[9]發現北大西洋微塑料碎片表面上存在著豐富的微生物群落結構（包括自養生物、異養生物、捕食者和共生體），并將此命名為“plastisphere”（塑料圈）。紅樹林生態系統是以紅樹植物為主要群落的濕地生態系統。擁有發達根系的紅樹林可通過消浪、緩流、纏繞等作用來捕獲或截留來自海陸環境中的塑料碎片。鑒于此，紅樹林濕地也被稱為近岸海域（微）塑料的“捕集器”[10]。Xie等[11]在紅樹林系統中的微塑料和根系土壤中均檢測出致病菌（副溶血性弧菌和埃希菌-志賀氏菌），并且發現二者之間的相互作用可能會影響紅樹林植物的生長代謝。目前，對于城市紅樹林系統中微塑料與微生物互作效應的研究非常缺乏，其中很多的科學問題仍不清楚。基于此，本研究以聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和具有可降解性的聚乳酸（PLA）為基質，選擇海南大學東坡湖紅樹林系統作為目標城市紅樹林系統，通過45 d的野外原位暴露實驗，探討城市紅樹林生態系統中微塑料表面細菌群落結構特征。以期為城市紅樹林生態系統健康評估、城市（微）塑料污染治理和政策制定提供參考依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

PE、PS、PVC和PLA等4種微塑料購買于安特塑膠原料有限公司，粒徑約為1 mm。E.Z.N. TM Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒、Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒及細菌引物341F（CCTACGGGN GCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTA TCC）均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供和合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?野外原位暴露試驗 ?本研究選取海南省海南大學東坡湖（20.06′ N，110.33′ E）作為微塑料暴露實驗現場試驗區。東坡湖的含鹽度約為23%，適合海桑、紅海欖、木欖、海蓮等紅樹植物生長，該區域中紅樹林帶寬約100 m，紅樹群落平均高度為2.5～3.5 m。試驗開始之前，采用無菌水清洗微塑料表面，除去其表面附著的有機物和微生物，自然干燥后，將20～30 g不同類型的微塑料分別放入尼龍網紗袋于2020年7月投放于水體中。調節樣品使其沉降到0.5 m水深處。暴露45 d后采集樣品，分別標記為LPE、LPS、LPVC和LPLA，周邊水域水樣（記為L）為對照樣品。用無菌水沖洗干凈，分裝后開展相關研究。

1.2.2 ?微塑料表面形貌觀察 ?使用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN MIRA3 LMH， Czech）觀察微塑料表面生物膜的表面形貌。觀察前，參照陳濤[8]的方法對樣品進行預處理，觀察時SEM的加速電壓為1.5 kV。以原生微塑料樣品作為空白對照組（CK）。

1.2.3 ?微塑料表面生物膜總量分析 ?使用結晶紫染色法分析測定微塑料表面生物膜的總量[8]。在分光光度計于595 nm下測定脫色液的吸光值，同時以95%乙醇作為空白。595 nm處的光密度（OD595nm）代表微塑料表面形成的生物膜總量。

1.2.4 ?微塑料表面生物膜DNA提取和測序 ?使用高通量測序技術分析微塑料表面生物膜細菌（擴增區域：16SV3-V4）的群落特征。PCR擴增體系：10～20 ng模板DNA，9～12 μL無菌水，1 μL Bar-PCR引物F、1 μL引物R、15 μL的2× ieff? Robust PCR Master Mix。PCR初始擴增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5次循環;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20次循環;最后在72 ℃下進行5 min的最終延伸。PCR二次擴增條件：95 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5次循環。擴增產物經2%瓊脂凝膠電泳初步篩選純化，后續測序過程基于Illumins MiSeq平臺由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.5 ?微塑料表面細菌群落結構多樣性分析 ?對原始數據進行拼接、過濾等優化處理后，得到的有效序列數，以97%以上的相似性將序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。檢測不同類型的微塑料表面生物膜的Alpha多樣性指數。Alpha多樣性中的Ace和Chao指數，描述群落豐富度，指數越大表示群落的豐富度越高;Shannon和Simpson指數，描述細菌群落多樣性;Shannon指數越大，Simpson指數越

小，表示細菌群落的多樣性及均勻度越高。繪制不同類型微塑料表面細菌和周圍水體的Venn圖。根據湖水和微塑料樣品的物種注釋結果和OTUs序列信息，獲得Bray-Curtis距離矩陣，對各樣品間細菌菌落的Beta多樣性進行進一步分析。繪制基于Bray-Curtis距離的熱圖、主協調分析（principal coordinated analysis，PCoA）和非度量多維校準分析（non-metric multidimensional calibration analysis，NMDS）圖，進一步對暴露后的微塑料及周圍水體中的微生物細菌群落結構相似性或差異性進行探究。

1.3 ?數據處理

采用Microsoft Excel 2019軟件對相關數據進行處理;采用SPSS19軟件進行數據統計分析，利用單因素分析（one-way ANOVA）來評估不同類型微塑料表面生物量之間的差異顯著性;使用Origin 8.0軟件和R語言軟件制圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?暴露處理對微塑料表面形貌的影響

經過45 d原位暴露處理后，東坡湖城市紅樹林系統中的4種微塑料表面形貌發生了明顯的變化。暴露處理前，4種微塑料的表面相對光滑（圖1A～圖1D）。暴露后，4種微塑料表面幾乎都被不同形態微生物和顆粒物所覆蓋（圖1E～圖1H）。LPE樣品表面附著團聚體狀的球狀細菌、桿狀細菌和沉積物顆粒（圖1E），LPS樣品表面清晰觀察到其褶皺附近聚集著大量球菌、桿菌等（圖1F），LPVC表面附著很多粒徑相對較大的球狀細菌（圖1H）。LPLA表面匯集了密集成團的球菌以及少量的桿菌（圖1G），同時還形成了大量的微孔結構，分析可能與附生細菌的降解作用有關。

2.2 ?暴露處理對微塑料表面生物膜的影響

由圖2可知，經過一定時間暴露后，LPE、LPS、LPVC和LPLA微塑料表面生物膜的總量均顯著高于原始微塑料（P<0.05），4種類型微塑料表面生物膜的總量差異顯著（P<0.05），其OD595nm值大小依次為：LPE>LPLA>LPS>LPVC。

2.3 ?不同類型微塑料表面細菌群落結構多樣性分析

對原始數據進行拼接、過濾等優化處理后，L、LPE、LPS、LPVC和LPLA得到的有效序列數分別為58 053、58 161、43 671、53 835和42 928條。所有處理的測序覆蓋率均高于99%，且稀釋曲線已趨于平緩，表明測序數據量大，樣品測序完整。

L、LPE、LPS、LPVC和LPLA的OTUs數量分別為（579±29）、（2136±107）、（1949±97）、（2065± 103）和（1906±95）（圖3）。各樣品間OTUs數量表現為L<LPVC<LPS<LPLA<LPE，說明微塑料可從水環境中富集微生物，且微塑料的類型可能是影響微塑料表面微生物生長的重要因素之一。

4種不同類型微塑料表面生物膜總量和OTUs存在顯著性差異，均表現為：LPE>LPLA>LPS> LPVC，說明塑料表面微生物群落結構特征與塑料材質類型有關。

2.3.1 ?Alpha多樣性 ?經過單因素（ANOVA）檢驗（圖4），不同類型的微塑料（LPE、LPS、LPVC和LPLA）表面生物膜的Alpha多樣性指數與周圍水體無顯著性差異（P>0.05），且與塑料材質的差異不顯著（P>0.05）。此外，暴露后微塑料樣品的Chao、Ace和Shannon指數明顯高于水體，Simpson指數低于水體，表明塑料圈上微生物群落較周邊水環境豐富，且分布更均勻。

從圖5可見，暴露于東坡湖后，微塑料表面細菌與其周圍水體共享OTUs數目為310個，約占微塑料樣品的15%～17%，表明微塑料表面有利于微生物的附著和生長，對水環境中微生物種群有選擇性吸附和富集作用。此外，各樣品也存在獨有的細菌OTUs：東坡湖水（L）中83個（14.34%），LPE表面98個（4.59%），LPS表面56個（2.87%），LPVC表面87個（4.56%），LPLA表面65個（3.15%）。

2.3.2 ?Beta多樣性 ?基于距離熱圖可發現（圖6A），在OTUs水平上，暴露后的所有微塑料（LPE、LPS、LPVC和LPLA）與東坡湖水的距離均在0.92以上，說明微塑料表面細菌群落結構與東坡湖水中的差異顯著。從PCoA和NMDS圖可看出（圖6B、圖6C），PCoA1的解釋度為52.08%，PCoA2的解釋度為27.08%，PCoA1和PCoA2共解釋了79.16%;湖水（L）中細菌群落與微塑料樣品（LPE、LPS、LPVC和LPLA）間表現出較高的差異性，與距離熱圖結果一致。

2.4 ?不同類型微塑料表面細菌群落結構組成

基于OTUs聚類結果，得到各樣品的細菌群落結構及其物種豐度的信息。本研究中共檢測到14個門、23個綱、29個目、34個科及38個屬。

在門水平上（圖7A），14個細菌物種群門均存在于水體和微塑料樣品上，但樣品間各物種的豐度明顯不同。暴露于水環境中后，4種微塑料樣品表面上優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria，28.07%～37.08%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，15.85%～24.53%）。相比于其他3種微塑料，LPVC表面含有較為豐富的儉桿菌門（Parcubacteria，12.31%）和綠細菌門（Chlorobi，7.27%）。在東坡湖水中，豐度前4位的菌為藍細菌門（Cyanoba?cteria_Chloroplast，49.50%）、變形菌門（Prote?obacteria，19.77%）、放線菌門（Actinobacteria，14.64%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，10.33%），總計占比高達94.25%。此外，原位投放的微塑料表面的藍細菌門和放線菌門在總量中的比例分別為0.91%～1.11%和2.59%～3.80%，這表明水環境中微生物在微塑料表面的定殖具有選擇性。

從綱水平來看（圖7B），LPE、LPS、LPVC和LPLA微塑料生物膜中的優勢菌群為-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，10.04%～19.42%）、-變形菌綱（Deltaproteobacteria， 5.07%～11.63%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，6.69%～10.15%）和黃桿菌綱（Flavobacteriia，3.01%～6.96%）。東坡湖水中藍藻細菌綱（Cyanobacteria，49.35%）的豐度最高，其次是放線菌綱（Actin?obacteria，14.64%）和-變形桿菌綱（Alphaprote?obacteria，9.95%）。

3 ?討論

本研究探討了城市紅樹林生態系統中PE、PS、PVC、PLA等4種微塑料表面微生物群落結構特征。結果表明，暴露于城市紅樹林生態系統中的微塑料表面附著有大量的微生物，主要以球菌和桿菌為主，與前人的報道一致[9， 12-13]。具有較大比表面積的發泡類微塑料可從水環境中吸附蛋白質等營養物質，進而吸引更多的微生物在其表面定殖[9， 12]。4種不同類型微塑料表面生物膜總量和OTUs均表現為LPE>LPLA>LPS>LPVC。PLA的合成原料中包含淀粉、糖類等物質，可為環境中微生物的生長活動提供營養物質。在本研究中，PE微塑料為發泡類材質，PLA為可生物降解塑料，PS和PVC塑料是普通樹脂顆粒，因此，發泡類PE和可生物降解的PLA更易于細菌微生物的快速定殖。基于Bray-Curtis距離的熱圖、PCoA和NMDS圖分析顯示，湖水（L）中細菌群落與微塑料樣品（LPE、LPS、LPVC和LPLA）間表現出較高的差異性，暴露于城市紅樹林生態系統中后，LPS和LPLA距離最為靠近，說明LPS和LPLA微塑料表面生物膜的細菌群落結構相似。LPVC與其他微塑料樣品相隔較遠，表明LPVC微塑料表面生物膜具有不同的微生物細菌群落結構。從細菌群落的多樣性分析結果可看出，微塑料的類型或結構是影響其表面定殖微生物群落多樣性的關鍵因素之一。

本研究的微塑料表面除了微生物外，在SEM上還觀察到大量的沉積物顆粒附著在微塑料表面，與Tu等[13]報道結果相似，這可能表明微塑料表面的部分微生物是來源于沉積物。在本研究中，未在微塑料的SEM圖上觀察到硅藻、絲狀菌等微生物，這可能與暴露水環境的類型以及其中的微生物優勢菌群有關聯。此外，暴露后微塑料表面細菌群落的多樣性顯著高于水環境，表明微塑料可從城市紅樹林生態系統中選擇性富集微生物，并為生長在該系統中的微生物提供新的棲息場所。本研究結果與Keswani等[14]報道一致，微塑料可以作為病原體、糞便指示生物和有害藻類在水生環境中持續存在和傳輸的重要載體。

在本研究中，變形菌門和擬桿菌門是微塑料表面細菌的優勢菌群，其相對豐度分別占細菌群落的19.77%～37.08%和10.33%～24.53%。Jiang等[15]通過對長江口潮間帶上微塑料表面生物膜的群落結構特征調查發現，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是主要的優勢菌群。陳濤[8]發現暴露于煙臺養馬島扇貝養殖區的微塑料表面微生物物種群門為33～43，其中變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是絕對優勢菌群。De Tender等[16]通過將塑料垃圾原位投放于比利時港口，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是PE微塑料表面的主要菌群。

隨著微塑料表面生物膜的形成及懸浮性顆粒物的附著，表面顏色加深，其密度增加，粒徑減小[8]，進而使得其沉降速度加快[17]。此外，微生物作用可加速破壞微塑料物理化學結構的完整性，使得微塑料表面粗糙度增加，甚至出現裂痕[8]。相關變化進一步影響微塑料的表面風化、沉降、降解、與污染物的互作效應等一系列環境行為過程。

此外，暴露于水環境中的微塑料也是病原菌（如弧菌屬、假單胞菌屬等）的棲息場所[9， 13， 18]。棲息在城市紅樹林生態系統中的生物攝食或攜帶致病微生物后，將會對生物甚至人類構成重大威脅。因此，城市紅樹林生態系統中微塑料表面附著的致病菌的特征及微生物群落的定殖對微塑料環境行為的影響將是后續研究的重點。

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責任編輯：黃東杰