睡蓮葉片胎生發育轉錄組分析

蘇群 田敏 李春牛 李先民 盧家仕 黃展文 李杰梅 卜朝陽 王虹妍

摘 ?要：睡蓮葉片胎生現象是繁育途徑的重要補充，對種群的傳播、擴散和生態環境的適應性有重要作用。通過轉錄組測序技術篩選和分析睡蓮葉片胎生現象相關的代謝路徑和調控基因，為深入認識睡蓮葉片胎生發育的分子機制提供參考。以葉片具有胎生現象的‘小花睡蓮’（X）和葉片無胎生現象的‘藍星睡蓮’（L）為材料，利用RNA-Seq技術對葉片4個發育階段的葉臍部分進行生物信息學分析。分析對照（L）和樣品（X）葉片不同發育階段測序結果：篩選出的差異表達基因（DEGs）中，34 909個基因（48.65%）表達上調，36 850個基因（51.35%）表達下調。DEGs分析顯示，隨著葉片的發育，X和L上調基因和下調基因數均呈增加趨勢。對L1-vs-X1、L4-vs-X4階段的GO和KEGG功能富集分析表明，DEGs主要富集在質膜和膜相關成分、胞外區域、細胞壁等相關的細胞組分中，涉及到代謝過程、生物合成和應急響應等;Pathway代謝通路表明，DEGs主要參與到植物激素信號轉導、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝、類黃酮生物合成、甘油磷脂類代謝以及細胞周期相關等過程。對DEGs進一步分析，克隆出了4個可能參與睡蓮葉片胎生發育的轉錄因子。

關鍵詞：睡蓮;葉片胎生;轉錄組分析;差異表達基因;代謝通路

中圖分類號：Q949.746.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Leaf vivipary in water lily （Nymphaea） is an important supplement to breeding， which plays an important role in the propagation and adaptability of species. Transcriptome sequencing technology was used to screen and explore genome-wide analysis of regulatory genes and metabolic pathways involved in leaf vivipary in water lily. This study would lay a foundation for further understanding the molecular mechanism of leaf viviparous development. Viviparous N. micrantha （X） and non-viviparous N. colorata （L） were selected as the experimental materials. By using RNA-Seq technology， four stages of leaf development of the leaf stalk and stem and stem join were tested and analyzed using a series of bioinformatics analysis. The result showed that 34 909 （48.65%） DEGs were up-regulated and 36 850 （51.35%） DEGs were down-regulated. DEGs analysis showed that up-regulated genes and down-regulated genes both increased with the leaves development of N. micrantha amd N. colorata. GO and KEGG enrichment analysis of L1-vs-X1 and L4-vs-X4 stage showed that DEGs were mainly enriched in plasmalemma， cytomembrane and extracellular domain cytoderm associated with ?metabolic process， biosynthesis and stimulus response. Pathway metabolism pathways indicated that DEGs were mainly involved in plant hormone signal transduction， phenylpropanoid biosynthesis， amino acids metabolism， flavonoid biosynthesis， glycerolipid metabolism and cell cycle and other processes. Four transcription factors potentially involved in leaf viviparous development of water lily were cloned based on DEGs analysis.

Keywords： water lily; leaf vivipary; transcriptome sequencing; DEGs; metabolic pathway

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.009

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea L.）多年生草本植物，花色豐富，花期長，適應性與抗逆性強，栽培容易且分布廣泛[1]。睡蓮屬為睡蓮科中最大的屬，約50余種（含變種），可分為subg. Nymphaea、subg. Anecphya、subg. Brachyceras、subg. Hydrocallis和subg. Lotos 5個亞屬[2-3]。睡蓮因其極高的觀賞價值和在植物進化、分類中的重要地位而越來越受到愛好者、育種家和植物學家的追捧[4-7]。部分熱帶睡蓮的葉片除進行光合作用外，還具有葉片胎生（vivipary）的特性，在其葉臍部位（葉片與葉柄連接處）長出新的植株[1]。胎生是植物另一種繁殖途徑，可使其種群在較短時間內快速傳播和擴散，更易適應多變而復雜的自然環境，此外胎生對生物多樣性保護，生態平衡的發展具有重要意義[8]。與睡蓮葉片胎生現象相關的內部代謝路徑和調控基因的研究則鮮見報道。

本研究利用Illumina測序平臺，以葉片具有胎生現象的‘小花睡蓮 ’（Nymphaea micrantha， X）和葉片無胎生現象的‘藍星睡蓮’（Nymphaea col-orata， L）為材料，對葉片4個發育階段的葉臍部分進行轉錄組測序，并重點比對分析了L1-vs-X1和L4-vs-X4階段的差異表達基因和代謝通路富集，以期篩選睡蓮葉片不同發育模式下的相關代謝路徑和參與葉片胎生發育的調控基因，為睡蓮葉片胎生發育的分子遺傳機制研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

‘小花睡蓮’（X）和‘藍星睡蓮’（L）均種植于廣西壯族自治區農業科學院花卉研究所睡蓮資源圃內，采用缸栽形式，水缸尺寸為口徑85 cm，深度50 cm，水深常年維持在25 cm左右。取‘X’（樣品）葉片和‘L’（對照）葉片4個不同發育階段的葉臍部位為材料（圖1），將相同基因型的材料6株混合取樣，并重復取樣1次。取樣后迅速放入液氮中保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取、文庫構建和轉錄組測序 ?委托攸歸（上海）生物科技有限公司完成RNA提取、文庫構建和轉錄組測序工作。采用CTAB法提取睡蓮總RNA并采用Agilent 2100進行質檢。RNA樣品檢測合格后，富集并打斷成短片段，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后進行PCR擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產物，得到最終的文庫。采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行雙末端測序。

使用NGS QC Toolkit[9]軟件對測序得到的原始數據進行質控以得到高質量的clean reads。使用hisat2[10]將clean reads與‘藍星睡蓮’的參考基因組進行比對（ftp：//download.big.ac.cn/gwh/Plants/ Nymphaea_colorata_Nym_GWHAAYW00000000/ GWHAAYW00000000.genome.fasta.gz），比對結

果以二進制binary文件即bam文件進行儲存。之后使用Cufflinks[11]對基因定量獲取FPKM值。采用htseq-count[12]軟件獲取落到各個樣本中基因的reads數目。

1.2.2 ?差異表達基因（DEGs）檢測、功能注釋和富集分析 ?使用STEM （Short Time-series Ex-pression Miner）軟件對不同發育階段的睡蓮葉片中基因的表達模式進行分析。并采用R中的pheatmap函數進行熱圖聚類分析。使用DESeq （2012） Rpackage的estimateSizeFactors函數對數據進行標準化，并使用nbinomTest函數計算差異比較的P value和fold change值。以P<0.05且fold change值2倍以上（上調或下調）作為篩選差異基因的標準。利用Blast2GO[12]軟件和KAAS軟件（https：//www.genome.jp/tools/kaas/）分別進行GO和KEGG[13]注釋和富集分析。重點選擇比對了L1-vs-X1、L4-vs-X4階段基因的差異表達情況，統計同種材料不同時期和不同材料同一時期轉錄組的DEGs，并進行GO和KEGG富集分析，以判定差異基因主要影響的代謝途徑和信號通路。

2 ?結果與分析

2.1 ?總RNA質量檢測和組裝結果分析

‘小花睡蓮’葉片和‘藍星睡蓮’葉片4個不同發育階段總計16份樣本，經檢測，樣品總RNA質量達到建庫要求，其中濃度為70～1230 ng/μL，A260/280為2.1～2.2，28S/18S為1.1～1.9，RIN≥7。

轉錄組測序共獲得134.97 Gb原始數據（表1），各樣本Q30值達到94%以上，GC≥49%，說明測序結果準確度較好，可用于后續分析。

2.2 ?轉錄組基因表達數據分析

為了分析‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’睡蓮葉片轉錄組中基因表達差異情況，做了全轉錄組表達基因熱圖。從圖2可看出，‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’中不同發育階段的葉片中基因表達差異較為明顯，L1-vs-X1、L4-vs-X4階段有著較為顯著的差異表達基因。同時進一步分析‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’葉片中不同表達基因的時空表達模式，利用STEM軟件對‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’8個組織進行了基因表達趨勢（Profile）分析。結果顯示共檢測到60個表達趨勢，其中‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’各30個（圖3）。在‘小花睡蓮’4個發育階段葉片中，表達趨勢8、12、4、18、0、14、25、13、21是顯著富集（P<0.05），分別包含2337、1302、1254、1157、1008、953、913、662、643個表達基因;在‘藍星睡蓮’4個發育階段葉片中，表達趨勢4、8、25、0、21、12是顯著富集（P<0.05），分別包含了3773、1919、1491、1153、838、675、530個表達基因。這些基因的大量表達，提示它們在此發育階段發揮重要作用。

2.3 ?差異表達基因的數據分析

如表2所示，在檢測到的DEGs中，上調差異基因34 909個（48.65%），下調差異基因36 850個（51.35%）。隨著葉片的發育，‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’上調基因和下調基因數均呈增加趨勢，各階段比對分析顯示，L1-vs-X1階段的DEGs為5559個，其中2033個基因表現為上調，3526個基因表現下調，下調基因數明顯多于上調基因數;L4-vs-X4階段的DEGs最多，高達7391個，其中2979個基因上調，4412個基因下調，同樣也是下調基因多于上調基因。L1-vs-X1和L4-vs-X4的DEGs韋恩圖分析表明，3507個DEGs在2個比對階段皆有表達，3884個DEGs在L4-vs-X4中差異表達，2052個DEGs在L1-vs-X1中表達（圖4）。根據試驗設計及數據結果初步推測3884個基因中可能存在睡蓮葉片胎生發育相關的基因。

2.4 ?差異表達基因的GO功能分析

為了進一步了解睡蓮葉片胎生發育分子機制，重點分析了L1-vs-X1階段的5559個DEGs以及L4-vs-X4階段的7391個DEGs的GO富集分析top30（篩選3種分類中對應基因數目大于2的GO條目，按照每個條目對應的-log10 P value由大到小排序的各前10條）。從圖5可知，DEGs在L1-vs-X1及L4-vs-X4階段均主要富集在細胞組分中，具體到質膜和膜相關成分、核小體、類囊體、胞外區域、細胞壁等的細胞組分中，涉及到代謝過程、生物合成等;在生物過程中，較多的DEGs歸類為次生代謝、光合呼吸反應、防衛反應、鐵離子運輸、應急響應及DNA復制和修復等;在分子功能分類中，參與結合、轉運和催化活性的DEGs最多。

2.5 ?差異表達基因的KEGG功能分析

KEGG是有關Pathway的主要公共數據庫，可以利用KEGG數據庫對差異Unigene進行Pathway富集分析（結合KEGG注釋結果）。L1-vs-X1階段以及L4-vs-X4階段的KEGG富集分析top20（以P≤0.01為篩選標準，同時過濾掉差異基因數目小于3的條目）如表3～表4所示。Pathway代謝通路表明DEGs主要參與到植物激素信號轉導、苯丙烷類生物合成、氨基酸類代謝、細胞周期、光合作用、類黃酮生物合成以及磷脂類代謝等相關過程。

L1-vs-X1階段植物激素信號轉導通路富集DEGs最多達到17個，7個基因表達上調，10個基因下調表達;其次，光合作用固碳路徑中有8個基因上調，2個基因下調;氨基酸代謝路徑富集9個DEGs，6個基因上調，3個基因表達下調;磷脂類代謝及葉綠色代謝類路徑各有8個DEGs，此外囊泡轉運互作路徑、DNA復制、類胡蘿卜素生物合成等路徑DEGs均達到了5個。L4-vs-X4階段植物激素信號轉導通路富集DEGs最多達18個，其中7個基因表達上調，11個基因表達下調;苯丙烷生物合成富集DEGs 15個，12個基因表達上調，3個基因表達下調;重點指出的是參與細胞周期-減數分裂相關的DEGs多達35個，其中22個基因上調，13個基因下調。此外，甘油磷脂類代謝路徑DEGs有10個，上調和下調表達基因各有5個;富集參與到脂肪酸代謝、類黃酮代謝、類固醇激素代謝及葉綠素代謝通路的DEGs也較多。綜上可知，L1-vs-X1階段及L4-vs-X4階段的植物激素信號轉導通路富集DEGs都是最多，且下調基因數多于上調基因數。

2.6 ?激素信號轉導途徑中顯著差異表達基因的篩選

為了探尋參與睡蓮葉片胎生的內部調控機制的基因，通過重點分析‘小花睡蓮’和‘藍星睡蓮’轉錄組數據，篩選‘小花睡蓮’顯著上調轉錄因子，并通過轉錄組reads組裝獲得基因全長。

以此為基礎，設計相關基因擴增引物，通過PCR克隆方法，得到4個轉錄因子基因，分別為ERF1B（NCBI登錄號：MT542693）、ERF105（NCBI登錄號：MT974544）、RAP2-3（NCBI登錄號：MT799791）和WRKY22（NCBI登錄號：MT 799792）。

3 ?討論

葉片通常被認為是植物進行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用的主要場所，部分葉片也具有觀賞價值和營養價值[14]。一些植物葉片還能夠從葉緣或者葉片中央部位長出新的完整植株，如伽藍菜屬的大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）[15]和睡蓮屬（Nymphaea spp.）的一些種（品種）[1， 8]等。葉片、花朵等植物營養器官的胎生是植物另一種繁殖途徑，可使其種群在較短時間內快速傳播和擴散，更易適應復雜而多變的自然環境。此外胎生對生物多樣性保護及生態平衡的發展具有重要意義，這種胎生能力受內部基因的調控，具有可遺傳性，植物通過這種方式可將進化的優良性狀一代代遺傳固定下來[8]。部分熱帶睡蓮也多以葉胎生的形式繁殖，但其形態發育和分子水平的內部調控的機理尚不清楚，有待于進一步研究。

本研究中L1-vs-X1和L4-vs-X4階段的植物激素信號轉導通路富集的DEGs都最多，說明在調控睡蓮葉片胎生苗發育過程中，植物激素信號一直發揮著重要作用，這與Kane等[16]探討植物激素對睡蓮胎生苗的研究的結果一致。在L1-vs-X1階段上調基因7個，下調基因10個;L4-vs-X4階段上調基因7個，下調基因11個，2個比對階段均有較多的上下調基因，維持著動態平衡。此外通過胎生和非胎生睡蓮種間轉錄組的比較試驗，發現生長素（AUX/IAA）、生長素應答因子（ARF）、植物生長素酰胺合成酶（GH3）和生長素上調小RNA（SAUR）的顯著差異調節。Aux/IAA是早期反應基因，能夠精確快速地觸發基因重編程[17]。ARF轉錄因子在生長素感知時被激活，并啟動下游信號通路，包括SAUR基因。SAURs調節許多生長素介導的反應，特別是通過細胞伸長的組織生長[18]。這些基因可能通過參與細胞分裂、擴大和分化而直接參與睡蓮胎生外部生長的發育[17]。生長素與細胞因子的結合也有助于細胞分化，細胞分裂素（CRE）的高表達可能是胎生細胞分化的原因之一，因為其對莖頂端分生組織的活性是已知的[19]。此外，有研究表明其他激素如乙烯等和IAA的互作來調控胎生苗根系的發育[20]。郭書磊等[21]利用RNA-Seq技術研究玉米葉片形態建成也得出多種植物激素相互作用通過參與調控玉米葉片寬窄的形態建成研究相同。綜上所述，植物激素間的相互作用和動態平衡對睡蓮葉片胎生發育有著重要的影響。

隨著近年鄉村振興和休閑旅游的興起，睡蓮因其迷人的外表而得到快速的推廣應用，但性狀優良的睡蓮品種往往不具有胎生能力，種苗繁育困難，導致價格居高不下，嚴重制約了其進一步的推廣應用。雖然目前在胎生睡蓮的形態解剖、分子水平上取得了一些進展，但引起胎生現象的內部調控機制并沒有得到系統解答，仍需進一步在分子水平上探究形成機理和挖掘重要功能基因。轉錄因子在植物的生長發育及其對外界環境的反應中起著重要調控作用，其序列和結構的多樣性決定了其功能的多樣性。通過睡蓮種間胎生和非胎生轉錄組的比較研究，挖掘出4個顯著差異表達的轉錄因子，分別為ERF1B、ERF105、RAP2-3和WRKY22。通過前人的研究得知AP2/ERF家族有多個成員能夠調節體細胞胚胎發生[22]，其中被研究得最多的是BABY BOOM （BBM）基因[23-27]和WOUND INDUCEDDEDIFFERENTI ATION 1 （WIND1）或RAP2.4基因[28]。也有研究表明WRKY家族轉錄因子通過參與其他激素介導的信號轉導來間接調節植物體細胞的發育[29-30]。AP2/ERF基因家族和WRKY等基因家族成員多而復雜，成員之間的功能差異很大，需具體到特定物種中進行功能驗證，如在蘋果中ERF1B基因能夠通過調控LOX途徑進行香氣的合成[31]。而在棉花中則可能參與抗黃萎病的調控[32]。

本研究通過轉錄組角度分析出植物激素間的相互作用和動態平衡對睡蓮葉片胎生發育有著重要的影響，并結合RT-PCR技術克隆了ERF1B、ERF105、RAP2-3和WRKY22等4個可能參與葉片胎生過程調控的轉錄因子基因，以期為睡蓮葉片胎生的內部代謝和基因調控提供一定理論基礎，今后還需對克隆出的4個轉錄因子作進一步的研究探討。

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責任編輯：黃東杰