甘蔗梢腐病菌FusariumsacchariCYP51基因克隆及遺傳轉化

周宇明 黃振 段真珍 李慧雪 暴怡雪 張木清 姚偉

摘 ?要：甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是生物細胞膜合成所需的一個非常重要的酶，在病原菌的耐藥性、致病性和生長繁殖等方面發揮著非常重要的作用。研究表明干擾真菌的CYP51基因表達導致其無法正常生長，顯著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）為試驗材料，根據基因組測序數據設計特異性引物克隆得到了FsCYP51基因全長和CDS全長。生物信息學分析表明，該基因序列全長1947 bp，編碼區由2個內含子和3個外顯子組成，CDS全長1554 bp，編碼517個氨基酸，編碼蛋白理論相對分子量為58.61 kDa。其編碼蛋白的二級結構主要由α-螺旋和無規卷曲構成，具有典型的CYP51保守結構域。預測其亞細胞定位于細胞膜，且存在2個跨膜區域。系統進化分析表明，FsCYP51基因屬于CYP51C這一類，與串珠鐮刀菌（F. verticillioides）的CYP51C基因親緣關系最近。同時，根據克隆到的基因全長和CDS全長構建了多價HIGS植物表達載體，并利用基因槍介導的遺傳轉化方法將干擾片段成功轉化至甘蔗受體材料，為研究FsCYP51基因功能和創制抗梢腐病甘蔗種質奠定基礎。

關鍵詞：甘蔗鐮刀菌;CYP51;基因克隆;HIGS;遺傳轉化

中圖分類號：S432.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： CYP51 is a very important enzyme for the biosynthesis of biological cell membrane， and plays a very impor-tant role in drug resistance， pathogenicity， growth and reproduction of pathogens. The interference with expression of CYP51 gene in fungi can prevent its normal growth and significantly reduce its pathogenicity. In this study， the full length of FsCYP51 gene and CDS were cloned by designing specific primers based on the genome sequencing data of Fusarium sacchari. Bioinformatics analysis showed that the total length of the gene was 1947 bp， and the coding region consisted of two introns and three exons. The total length of CDS was 1554 bp， encoding 517 amino acids. The theoretical relative molecular weight of the coding protein was 58.61 kDa. The secondary structure of the encoded protein was mainly composed of α-helix and random coils， and it had a typical conserved domain CYP51. Its subcellular localization was predicted in the cell membrane and there were two transmembrane regions. Phylogenetic analysis showed that the FsCYP51 gene belonged to the CYP51C class， and was closely related to the CYP51C gene of F. verticillioides. At the same time， according to the full length of the gene and CDS， the polyvalent HIGS plant expression vector was constructed， and transformed into sugarcane by particle bombardment，which would lay a foundation for the study of function of FsCYP51 gene and the creation of transgenic sugarcane resistant to Pokkah boeng disease.

Keywords： Fusarium sacchari; CYP51; gene cloning; HIGS; genetic transformation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.011

甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬禾本科甘蔗屬植物，是我國最主要的糖料作物[1]。甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease）是一種世界分布廣泛的真菌性病害[2]。甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）是中國甘蔗梢腐病的主要病原菌菌之一[3]。近幾年由于甘蔗的連年種植以及新臺糖系列等易感病品種的大面積推廣[4]，我國的甘蔗梢腐病呈現爆發的趨勢，嚴重影響了甘蔗的生產和種植區經濟的發展，已逐漸成為我國甘蔗的主要病害之一[5-6]。因此對甘蔗梢腐病的防控將是甘蔗產業急需解決的問題。

甾醇14α-去甲基化酶（sterol 14α-demethy?lase，P45014DM， CYP51）屬于細胞色素P450超家族成員，是生物細胞膜形成所需的一個非常重要的酶[7]。CYP51的缺乏將導致細胞膜無法正常形成，最終導致真菌無法正常生長[8]。目前研究人員已在多種病原真菌中發現了CYP51的同源基因，不同真菌的CYP51基因數目是不盡相同的，有的真菌僅含有CYP51A一種，某些真菌如煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、構巢曲霉（Aspergillus nidμLans）、稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）等有CYP51A和CYP51B兩種[9]，指狀青霉（Penicillium digitatum）[10]、禾谷鐮刀菌（Fusarium gramin?earum）[11]等有CYP51A、CYP51B 和CYP51C三種。通過對CYP51同源基因的功能研究發現CYP51基因的功能非常豐富，在病原菌的抗藥性、致病性、孢子產生等方面起著重要作用。例如在引起柑橘腐爛的指狀青霉中，PdCYP51A和PdCYP51B基因會影響它的抗藥性[10]。在一些絲狀真菌如煙曲霉菌[12]、禾谷鐮刀菌[13]中發現的同源CYP51基因被證實與病原菌對DMI殺菌劑的敏感性有關，這可能是真菌抗DMI的一種新機制。在禾谷鐮刀菌中，FgCYP51A和FgCYP51B都能編碼14α-去甲基化酶，FgCYP51B同時對病原菌的子囊孢子形成起重要作用，FgCYP51C不編碼14α-脫甲基化酶但對病原菌的毒力至關重要[11]。

寄主誘導的基因沉默（host-induced gene si-lencing， HIGS）是基于RNAi的一種新型抗病育種技術，通過在寄主植物中表達病原菌基因的dsRNA來沉默病原菌中靶標基因的表達達到抗病的效果。HIGS技術不僅可以用來研究病原菌重要致病基因功能，而且也是創制抗病轉基因作物的一種新方法，在小麥條銹病[14]、小麥赤霉病[15]、水稻稻瘟病[16]、香蕉枯萎病[17]等的研究中有著充分的運用，但目前HIGS技術在甘蔗上的應用較少，因此建立適用于甘蔗梢腐病菌基因功能研究的HIGS體系是研究甘蔗梢腐病菌致病機制所必需的，也是創制抗病甘蔗新種質的一種快速有效的方法。

利用HIGS技術沉默病原菌CYP51基因表達可以提高轉基因作物的抗病性。Koch等[18]利用HIGS技術在擬南芥和大麥中表達了禾谷鐮刀菌（F. graminearum）FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因串聯片段的dsRNA，得到的轉基因大麥和擬南芥對禾谷鐮刀菌的抗性顯著提高。目前關于甘蔗鐮刀菌CYP51基因的研究尚未見報道，本研究基于課題組分離到的甘蔗梢腐病甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）野生型菌株CNO-1及其基因組數據，從甘蔗鐮刀菌中成功克隆其CYP51基因全長和CDS全長，采用生物信息學方法對其理化性質、基因結構、保守結構域、二級結構、進化關系等進行了分析，同時，基于克隆到的基因全長和CDS全長，選取了保守且特異3個區段作為靶標片段并構建了HIGS多價干擾載體，并成功轉化至甘蔗，為研究甘蔗鐮刀菌CYP51基因功能和創制抗梢腐病轉基因甘蔗的打下基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

材料：甘蔗梢腐病主要致病菌甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）菌野生型菌株CNO-1由課題組分離獲得，并對其進行了精細基因組測序與序列分析（待發表），獲得了FsCYP51基因全長和CDS全長序列。易感梢腐病甘蔗品種‘中蔗1號’由課題組提供。

試劑：反轉錄試劑盒、各類限制性核酸內切酶、T4-DNA連接酶、DNA Marker購自Takara（大連）公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購買自北京天根生化科技有限公司;引物合成、序列測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成;HIGS植物干擾表達載體pBWA（V）BU載體由課題組保存;用于RNA提取用的Trizol試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司;各類PCR Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;平端克隆pEASY?-Blunt Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司;基因槍（Bio-Rad PDS-1000/He）及其耗材均購自Bio- Rad公司;其他試劑和耗材購自生工生物工程（上海）股份有限公司或國產分析純試劑。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因組DNA和總RNA的提取及cDNA合成 ? 用課題組改良的SDS法提取甘蔗鐮刀菌基因組DNA。使用Trizol法提取甘蔗鐮刀菌總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計（nanodrop）檢測所提取的DNA和RNA的純度和濃度。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行cDNA合成，反應體系與程序參照試劑盒說明書進行。提取的基因組DNA用于基因全長克隆，逆轉錄得到的cDNA用于CDS全長克隆。

1.2.2 ?甘蔗鐮刀菌FsCYP51基因全長和CDS全長克隆 ?根據課題組前期基因組測序的結果，用軟件Primer Premier 5分別設計擴增基因全長的特異引物FsCYP51QC-F/R和擴增基因CDS的特異引物FsCYP51CDS-F/R（表1）。用引物FsCYP51QC-F/R和引物FsCYP51CDS-F/R分別以基因組DNA和cDNA為模板進行PCR，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收長度符合預期的條帶，連接到克隆載體pEASY?-Blunt上，轉化大腸桿菌（E. coli）Top10感受態細胞，PCR鑒定陽性克隆后提取質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 ?FsCYP51基因的生物信息學分析 ?利用在線分析工具ProtParam（https：//web.expasy.org/ protparam/）對FsCYP51蛋白序列進行分析;利用在線軟件GSDS2.0[19]（http：//gsds.gao-lab.org/）對FsCYP51的基因結構進行分析;利用NCBI CDD數據庫分析FsCYP51蛋白的保守功能結構域;利用在線軟件SignalP-5.0 Server分析FsCYP51蛋白的信號肽;用在線分析軟件NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對FsCYP51蛋白潛在的磷酸化修飾位點進行預測;通過在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）分析FsCYP51蛋白二級結構;利用在線軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi？id=index）預測FsCYP51蛋白三級結構;利用在線工具TMHMM Server v2.0（http：// www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析FsCYP51蛋白可能的跨膜結構;運用在線工具CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）預測FsCYP51蛋白亞細胞定位;用FsCYP51蛋白序列在NCBI數據庫中Blast并下載搜索到的常見鐮刀菌CYP51蛋白序列，用MEGA 6軟件釆用鄰近法（neighbor-joining，bootstrap replications=1000）構建系統進化樹。

1.2.4 ?FsCYP51基因HIGS植物表達載體的構建

根據克隆到的FsCYP51的CDS序列和基因全長序列，選取FsCYP51基因CDS的2個特異區段和UTR區的1個區段，并將這3個區段串聯成一個片段作為HIGS靶標片段，串聯片段由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。結合RNAi植物表達載體上的酶切位點，利用Primer Premier 5設計了分別用于擴增正向靶標序列tgtf、反向靶標序列tgtr和連接它們的loop片段的引物tgtf-F/R、tgtr-F/R和loop-F/R（表1），以合成的靶標片段為模板進行PCR，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收相應的目的片段。將載體pBWA（V）BU用限制性內切酶Eco31 I酶切線性化，3個擴增回收目的的片段用Aar I進行酶切，回收酶切產物。將3個酶切目的片段和線性化載體在同一反應中進行連接，連接體系：T4 DNA Ligase 1 μL，10×Buffer 1 μL，線性化pBWA（V）BU載體1 μL，tgtF片段1 μL，tgtR片段1 μL，loop片段0.5 μL，16 ℃連接過夜，轉化Top10感受態細胞后，在含50 mg/L Kan的培養基平板上培養12～14 h，隨機挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，然后將陽性克隆擴大培養后提取質粒進行測序。

1.2.5 ?基因槍介導HIGS表達載體遺傳轉化甘蔗

將測序驗證正確的陽性克隆擴大培養，提取大量質粒。參考吳楊[20]的方法轉化甘蔗，利用基因槍在71.12 cm汞柱真空度，1100 psi轟擊壓力和6 cm轟擊距離的條件下轟擊甘蔗胚性愈傷組織，在含有G418的培養基經過篩選、分化和生根等一系列培養后得到抗性植株，用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA，稀釋基因組DNA濃度至50 ng/μL，以此為模板，同時以構建好的干擾重組載體質粒為陽性對照，未轉化的甘蔗植株基因組DNA為陰性對照，用于溶解DNA的ddH2O作為空白對照，為了提高PCR檢測的準確性，根據干擾表達載體序列和靶標基因序列設計如表1中的tgtf-F/R和G418-F/R這2對引物進行PCR檢測轉基因植株，這2對引物擴增到的預期片段大小分別為645 bp和1660 bp。

2 ?結果與分析

2.1 ?FsCYP51的基因全長和CDS克隆

將提取的甘蔗鐮刀菌總RNA和基因組DNA用nanadrop測量濃度和純度，結果顯示提取的RNA的濃度在300 ng/μL左右，A260/A280比值在1.9～2.1的范圍內，DNA的濃度在700 ng/μL左右，A260/A280比值在1.8～2.0的范圍內，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示提取的DNA和RNA的完整

性較好，可以進行下一步實驗。用引物FsCYP51 QC-F/R以基因組DNA為模板進行基因全長擴增;用南京諾唯贊反轉錄試劑盒以RNA為模板進行cDNA合成，然后用引物FsCYP51CDS-F/R以得到的cDNA為模板進行CDS全長擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠（圖1），可以得到長度分別為2000 bp左右的基因全長片段和1500 bp左右的CDS全長片段，回收相應的片段連接到克隆載體，用M13通用引物對陽性重組質粒進行測序，結果顯示克隆到的FsCYP51的基因全長和CDS全長與基因組的數據是一致的，FsCYP51基因全長1947 bp，CDS全長1554 bp，編碼517個氨基酸。

2.2 ?FsCYP51基因的生物信息學分析

2.2.1 ?FsCYP51基因結構分析及其編碼蛋白的理化性質分析 ?將克隆到的FsCYP51基因全長和CDS全長通過在線軟件GSDS2.0進行基因結構分析（圖2），結果顯示FsCYP51基因編碼區由3個外顯子和2個內含子組成。利用ProtParam在線分析軟件對FsCYP51蛋白氨基酸進行理化性質分析。FsCYP51蛋白由517個氨基酸組成，理論分子量為58.61 kDa，理論等電點pI=6.61。不穩定指數為42.87，說明該蛋白的穩定性較差。此外，脂肪族氨基酸指數達83.52，總平均親水指數為–0.239，說明該蛋白為親水性蛋白。利用程序ProtScale對FsCYP51蛋白氨基酸的親水性進行在線分析，組成FsCYP51蛋白的氨基酸多為親性氨基酸，表明該蛋白有較強的親水性。

2.2.2 ?FsCYP51蛋白信號肽、跨膜結構及亞細胞定位預測 ?用在線工具TMHMM Server v. 2.0對FsCYP51蛋白的跨膜結構進行了預測（圖3），發現在FsCYP51蛋白第26位至第45位氨基酸和第57位至第77位氨基酸可能是2個跨膜螺旋，由此推測FsCYP51蛋白為跨膜蛋白。通過SignalP-5.0對FsCYP51蛋白進行分析，發現其不含有信號肽，表明FsCYP51蛋白不是分泌型蛋白。通過在線工具CELLO v.2.5預測FsCYP51蛋白的亞細胞定位，預測結果顯示FsCYP51蛋白定位在細胞質膜、溶酶體、細胞質、線粒體、葉綠體的可能性分別為1.953、0543、0.489、0.374、0.369，預測FsCYP51蛋白定位在細胞膜。

2.2.3 ?FsCYP51基因編碼氨基酸磷酸化修飾的預測和分析 ?通過在線分析軟件NetPhos 3.1 Server將FsCYP51蛋白的氨基酸序列進行磷酸化修飾預測。結果顯示，FsCYP51蛋白質的多個氨基酸位點可以發生潛在的磷酸化修飾，預測FsCYP51蛋白質中有20個Ser（絲氨酸）位點可發生磷酸化修飾，有17個Thr（蘇氨酸）位點可發生磷酸化修飾，9個Tyr（酪氨酸）位點可發生磷酸化修飾（圖4）。此外發現FsCYP51蛋白可能存在cdc2蛋白激酶的4個Ser和3個Thr磷酸化位點，而且可能存在蛋白激酶C（PKC）的4個Ser和7個Thr磷酸化位點，推測FsCYP51蛋白可能需要進行磷酸化修飾來激發其活性。

2.2.4 ?FsCYP51蛋白二級結構、三級結構和功能結構域分析 ?將甘蔗梢腐病菌FsCYP51蛋白通過SOPM和Phyre2進行二級結構（圖5A）和三級結構分析（圖5B），結果表明FsCYP51蛋白的二級結構有α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲，分別占比47.97%、11.61%、3.09%和37.33%。因此FsCYP51蛋白的二級結構主要以α-螺旋和無規卷曲的結構形式存在。利用NCBI的CDD功能分析FsCYP51蛋白的保守結構域（圖6），發現在其第72位至第510位氨基酸序列之具有CYP51- like保守結構域，說明該蛋白屬于p450家族中的CYP51蛋白。

2.2.5 ?FsCYP51基因系統進化樹構建分析 ?為了解FsCYP51基因在鐮刀菌中的進化情況，用FsCYP51蛋白序列在NCBI數據庫中進行BLAST，下載了常見鐮刀菌的CYP51蛋白。利用MEGA 6選擇鄰近法構建系統進化樹（圖7）。可以明顯地看出系統進化樹按照CYP51A、CYP51B和CYP51C這三類分為3個分支，FsCYP51基因屬于CYP51C這一類基因。其中F. sacchari CYP51（FsCYP51）與串珠鐮刀菌F. verticillioides CYP51C、尖孢鐮刀菌F. oxysporum CYP51C、頂腐病菌F. subglutinans CYP51C和層出鐮刀菌F. proliferatum CYP51C基因在CYP51C類的同一小簇中，說明它們的同源性更高，表明這5個基因在進化關系上更為接近，物種進化關系較為密切。其中FvCYP51與FsCYP51的同源性最高，表明這2個真菌在物種進化過程中親緣關系更近。

2.3 ?FsCYP51基因HIGS植物表達載體的構建

根據干擾載體pBWA（V）BU和多價靶標片段的序列，設計了3對帶有酶切位點的引物（表1）。以含有多價靶標序列的克隆載體為模板進行PCR擴增正向靶標序列（tgtF）和反向靶標序列（tgtR）（圖8A），以含有loop序列的干擾載體pBWA（V） BU為模板擴增loop序列（圖8B）。將上述PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠純化回收大小符合的條帶，可獲得帶有相應酶切位點的大小分別為645 bp、645 bp和200 bp的正向靶標片段、反向靶標片段和loop片段。測量純度和濃度后，將載體pBWA（V）BU用限制性內切酶Eco31 I酶切線性化，3個擴增回收目的的片段用Aar I進行酶切，回收酶切產物。將3個酶切目的片段和線性化載體在同一反應中進行連接，然后轉化Top10感受態細胞。根據載體序列和loop序列設計分別設計了用來檢測正向靶標序列（Pubiseq-F/ loop-R）和反向靶標序列的兩組引物（表1）。隨機選取若干個轉化后在抗性平板上長出的單菌落進行菌液PCR鑒定，預期擴增的片段大小分別為929 bp和960 bp，電泳結果（圖8C）與預期的大小一致。提取陽性菌液質粒，用限制性內切酶酶Eco32I進行酶切驗證，酶切產物電泳結果與預期結果一致。提交陽性質粒至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與預期一致，FsCYP51基因HIGS植物表達載體構建成功，可用于遺傳轉化甘蔗研究。

2.4 ?轉基因植株的PCR鑒定

用改良CTAB法提取的抗性植株基因組DNA，以其為模板，同時分別以重組干擾載體作為陽性對照，以未轉基因甘蔗為陰性對照，以用于溶解基因組DNA的ddH2O為空白對照，用引物tgtf-F/R和G418-F/R進行PCR檢測。引物tgtf-F/R和引物G418-F/R的PCR產物電泳結果顯示分別有8株（圖9A）和7株（圖9B）抗性植株的基因組DNA擴增到了相應預期大小的條帶，而陰性對照和空白對照沒有對應的電泳條帶，綜合2對引物的PCR鑒定均為陽性的結果，表明HIGS載體上的外源DNA片段已整合到甘蔗基因組中。

3 ?討論

CYP51首次是從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分離獲得[21]，并且在動物（大鼠）[22]、植物（高粱）[23]、細菌（結核分枝桿菌）[24]中相繼被發現，是分布最廣的P450家族成員。目前研究者已在多種病原鐮刀菌如禾谷鐮刀菌（F. gra-minearum）、串珠鐮刀菌（F. verticillioides）和尖胞鐮刀菌（F. oxysporum）等中發現了CYP51A、CYP51B、CYP51C這3個同源基因[25]。研究表明CYP51C基因是鐮刀菌屬物種特有的，可以作為鑒定鐮刀菌屬的一個特殊標記基因[11]。本研究根據課題組對分離得到的甘蔗梢腐病菌（Fusarium sac-chari）野生型菌株CNO-1的基因組測序結果，成功克隆到甘蔗梢腐病菌FsCYP51基因全長和CDS全長，對其序列進行了相關的生物信息學分析。

本研究對FsCYP51蛋白的親水性、蛋白理化性質、氨基酸磷酸化修飾、蛋白二級結構、蛋白跨膜結構、亞細胞定位預測以及系統進化樹等進行預測或分析。氨基酸的親疏水性可以反映蛋白質的折疊情況，在潛在的跨膜區域會出現疏水區，在保持蛋白質的三級結構上起重要作用，而且蛋白的親疏水性圖譜可為蛋白跨膜區域的鑒定提供參考。蛋白跨膜結構域為膜蛋白與膜脂相結合的主要部位。FsCYP51蛋白氨基酸多為親水性氨基酸，結構上最主要是α-螺旋。通過結合蛋白親水性分析和跨膜結構預測結果，說明FsCYP51蛋白可能為跨膜蛋白，這與禾谷鐮刀菌中的研究是一致的[26]。亞細胞定位預測結果顯示FsCYP51蛋白可能定位在細胞膜中，這也符合其為膜結合蛋白的特征[27]。

研究表明禾谷鐮刀菌（F. graminearum）中的3個CYP51基因有著不同的功能，FgCYP51A和FgCYP51B編碼14α-脫甲基酶，FgCYP51B同時對病原菌的子囊孢子形成起重要作用，FgCYP51C不編碼14α-脫甲基酶但對病原菌的毒力至關重要[11]。而在甘蔗鐮刀菌（F. sacchari）中只鑒定到1個CYP51基因，經過序列比對和系統進化樹分析，可以看出FsCYP51屬于CYP51C這一類基因，這與其為鐮刀菌的鑒定結果是一致的。FsCYP51與FvCYP51C的同源性最高，達到了84.53%，這也符合這2個物種更為接近的親緣關系。甘蔗鐮刀菌中沒有CYP51A和CYP51B這2個基因，推測FsCYP51這個基因的功能可能會更加豐富，不僅僅編碼14α-脫甲基酶，可能還與病原菌致病性、毒力、子囊孢子形成等密切相關，這將是下一步研究的重點，所以構建了HIGS植物表達載體，并成功轉化甘蔗，為進一步探究甘蔗鐮刀菌中CYP51基因的功能和創制抗梢腐病的轉基因甘蔗打下基礎。同時HIGS技術在甘蔗抗梢腐病研究中的應用還未見報道，本研究是在甘蔗中轉入甘蔗梢腐病菌重要基因干擾片段來進行HIGS試驗，具有重要的理論意義與應用價值。

參考文獻

[1] Chen R K， Yuan Z N. Sugarcane production and research in China[J]. International Sugar Journal， 2010， 112（1340）： 452-457.

[2] Leslie J F. Mating populations in Gibberella fujikuroi （Fusarium section Liseola）[J]. Phytopathology， 1991， 81（9）： 1058-1060.

[3] Meng J R， Huang H J， Li Y X， et al. First report of Fusarium sacchari causing sugarcane pokkah boeng in China[J]. Plant Disease， 2020， 104（5）： 1553-1554.

[4] 古幸靈， 楊欣欣， 黃 ?治， 等. 甘蔗梢腐病流行原因及綜合防治對策[J]. 鄉村科技， 2020（11）： 82-83.

[5] 王澤平， 陳 ?奕， 孫海軍， 等. 廣西甘蔗主栽品種梢腐病田間抗性初步評價[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（5）： 952-957.

[6] 盧文潔. 甘蔗梢腐病的發生及綜合防治措施[J]. 作物雜志， 2007（2）： 92.

[7] Yoshida Y， Aoyama Y， Noshiro M， et al. Sterol 14-demethylase P450 （CYP51） provides a breakthrough for the discussion on the evolution of cytochrome P450 gene superfamily[J]. Biochemical and biophysical research com-munications， 2000， 273（3）： 799-804.

[8] Lepesheva G I， Waterman M R. CYP51—the omnipotent P450[J]. Molecular and cellular endocrinology， 2004， 215 （1-2）： 165-170.

[9] Lepesheva G I， Waterman M R. Sterol 14α-demethylase cytochrome P450 （CYP51）， a P450 in all biological king-doms[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-General Subjects， 2007， 1770（3）： 467-477.

[10] Sun X， Wang J， Feng D， et al. PdCYP51B， a new putative sterol 14α-demethylase gene of Penicillium digitatum in-volved in resistance to imazalil and other fungicides inhibit-ing ergosterol synthesis[J]. Applied microbiology and bio-technology， 2011， 91（4）： 1107-1119.

[11] Fan J， Urban M， Parker J E， et al. Characterization of the sterol 14α‐demethylases of Fusarium graminearum identi-fies a novel genus‐specific CYP51 function[J]. New Phy-tologist， 2013， 198（3）： 821-835.

[12] Martel C M， Parker J E， Warrilow A G， et al. Complementa-tion of a Saccharomyces cerevisiae ERG11/CYP51 （sterol 14α-demethylase） doxycycline-regulated mutant and screening of the azole sensitivity of Aspergillus fumigatus isoenzymes CYP51A and CYP51B[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy， 2010， 54（11）： 4920-4923.

[13] Liu X， Yu F， Schnabel G， et al. Paralogous cyp51 genes in Fusarium graminearum mediate differential sensitivity to sterol demethylation inhibitors[J]. Fungal Genetics and Bi-ology， 2011， 48（2）： 113-123.

[14] Qi T， Zhu X， Tan C， et al. Host‐induced gene silencing of an important pathogenicity factor PsCPK1 in Puccinia striiformis f. sp. tritici enhances resistance of wheat to stripe rust[J]. Plant biotechnology journal， 2018， 16（3）： 797-807.

[15] Cheng W， Song X S， Li H P， et al. Host‐induced gene si-lencing of an essential chitin synthase gene confers durable resistance to Fusarium head blight and seedling blight in wheat[J]. Plant biotechnology journal， 2015， 13（9）： 1335- 1345.

[16] 王夢穎， 劉 ?敬， 瞿紹洪， 等. 水稻抗稻瘟菌HIGS表達載體的構建及遺傳轉化[J]. 植物保護， 2015， 41（3）： 73-78+ 114.

[17] Ghag S B， Shekhawat U K， Ganapathi T R. Host‐induced post‐transcriptional hairpin RNA‐mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium wilt in banana[J]. Plant biotechnology journal， 2014， 12（5）： 541-553.

[18] Koch A， Kumar N， Weber L， et al. Host-induced gene si-lencing of cytochrome P450 lanosterol C14α-demethylase– encoding genes confers strong resistance to Fusarium spe-cies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2013， 110（48）： 19324-19329.

[19] Hu B， Jin J， Guo A-Y， et al. GSDS 2.0： an upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics， 2014， 31（8）： 1296-1297.

[20] 吳 ?楊. 斑茅DREB2B基因遺傳轉化甘蔗的抗旱性研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2009.

[21] Yoshida Y， Aoyama Y. Yeast cytochrome P-450 catalyzing lanosterol 14α-demethylation I. Purification and spectral properties[J]. Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（3）： 1655-1660.

[22] Trzaskos J M， Kawata S， Gaylor J L. Microsomal enzymes of cholesterol biosynthesis. Purification of lanosterol 14 α-methyl demethylase cytochrome P-450 from hepatic microsomes[J]. Journal of Biological Chemistry， 1986， 261（31）： 14651-14657.

[23] Kahn R A， Bak S， Olsen C E， et al. Isolation and reconstitution of the heme-thiolate protein obtusifoliol 14α-demethylase from Sorghum bicolor （L.） moench[J]. Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（51）： 32944-32950.

[24] Bellamine A， Mangla A T， Nes W D， et al. Characterization and catalytic properties of the sterol 14α-demethylase from Mycobacterium tuberculosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1999， 96（16）： 8937-8942.

[25] Ma L-J， Van Der Does H C， Borkovich K A， et al. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium[J]. Nature， 2010， 464（7287）： 367-373.

[26] 孫曉梅， 黃金光. 禾谷鐮刀菌致病性蛋白CYP51C cDNA克隆及生物信息學分析[J]. 山東農業科學， 2015， 47（09）： 1-6.

[27] 楊嬌艷， 廖明軍， 楊 ?劭. 甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）的研究進展[J]. 生物工程學報， 2008（10）： 1681-1688.

責任編輯：沈德發