甜橙Dof基因家族鑒定與表達分析

楊杰 陳蓉 胡文娟 吳巧玲 佟曉楠 李興濤

摘 ?要：為研究甜橙單鋅指DNA結合蛋白（DNA binding with one zine finger， Dof）家族的進化關系和該家族成員在不同花期甜橙品種花芽和葉片的表達模式，利用甜橙基因組篩選鑒定CsDof基因家族成員，對甜橙Dof基因家族成員及啟動子區進行生物信息學分析，并使用qRT-PCR檢測不同花期甜橙品種中CsDof家族成員在成花時期的表達情況。共鑒定出24個CsDof基因家族成員，這些基因分布在甜橙的8條染色體上。系統進化樹聚集為9個亞群，CsDofs被分在A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、D1和D2亞群，同一亞群的CsDofs具有相似的基因結構和基序分布。CsDofs啟動子區域含大量的光響應元件和激素響應元件。qRT-PCR檢測分析發現2個甜橙品種花芽和葉片組織中的CsDofs表達模式存在較大差異，對照品種‘紐荷爾’花芽和葉片中CsDof6、CsDof11、CsDof13、CsDof17和CsDof21表達量均高于早熟品種‘贛南早’，而‘贛南早’花芽和葉片中CsDof19和CsDof23表達量高于‘紐荷爾’，表明CsDofs在不同花期的甜橙中具有明顯的品種表達特異性，推測CsDofs對甜橙開花時間起重要的調控作用。這些結果為闡明CsDof基因家族在甜橙花期調控中的功能提供了理論參考。

關鍵詞：甜橙;Dof基因家族;生物信息學;基因表達

中圖分類號：S666.4 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The DNA binding with one zine figer proteins （Dof） in Citrus Sinensis was identified by bioinformatics， and the evolution model and expression pattern were analyzed. Used the recently released upland C. Sinensis genomic data， Dof genes in C. Sinensis were identified by bioinformatic methods. The chromosomal localization， physicochemical properties， sequence characteristics， phylogeny， cis-acting elements and expression profile of Dof genes in C. Sinensis were systematically analyzed. We identified 24 Dof genes which were distributed on 8 chromosomes. The phylogenet-ic-tree was clustered into 9 subgroups， and CsDof genes were divided into A， B1， B2， C1， C2.1， C2.2， D1 and D2 sub-groups. The promoter region of CsDof genes contained a large number of light-responsive and hormone-responsive elements. The expression pattern of CsDof genes was different in buds and leaves of two sweet orange varieties by ?quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. The expression of CsDof6， CsDof11， CsDof13， CsDof17 and CsDof21 in ‘New-hall’ cultivars was higher than that in buds and leaves of ‘Gannan Zao’ cultivars， while that of CsDof19 and CsDof23 in ‘Gannan Zao’ cultivars was higher than that in buds and leaves of ‘Newhall’ cultivars. The CsDof genes had obvious specificity of variety expression in sweet orange at different flowering stages， it suggesting CsDof genes played an im-portant role in the regulation of flowering time. The results would provide references for clarifying the functions of CsDof gene family in the regulation of flowering stage.

Keywords： Citrus Sinensis; Dof gene family; bioinformatics; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.013

單鋅指DNA結合蛋白（DNA binding with one zine finger， Dof）是植物特有的轉錄因子，在調控其生長發育、開花周期等過程中發揮重要作用。Dof蛋白具有N末端高度保守Dof結構域和C末端轉錄調控域[1]。其中，Dof結構域為含有52個氨基酸殘基的C2-C2型單鋅指結構，可識別AAAG/CTTT順式作用調控元件[2];C末端轉錄調控域具有不同氨基酸序列，表明其具備多種蛋白功能[3]。

Dof蛋白家族廣泛存在于植物中，參與植物生長發育過程及抗逆反應，包括植物種子萌發、開花調控和非生物脅迫等[4]。目前，擬南芥[5]、水稻[6]、番茄[7]和玉米[8]等植物的Dof基因家族已被陸續鑒定。其中，部分Dof基因家族成員的功能已經被驗證。AtCDFs通過控制光周期調控擬南芥花期[9]，其在番茄中的同源基因也調控花期[10];AtDof5.8可提高擬南芥對干旱和鹽脅迫的抗逆性[11];OsDof12調控長日照條件下水稻花期[12];ZmDof1可抑制Zm401的表達來調控玉米的花粉發育[13]。

甜橙（Citrus sinensis）作為柑橘中最主要的鮮食類群，營養豐富、口感清爽而廣受消費者青睞。甜橙花器發育影響其果實熟期和產量，國家臍橙工程技術研究中心選育的特早熟甜橙品種‘贛南早’具有早花早結豐產的優點[14]。多年的研究結果發現，‘贛南早’甜橙的成花期比對照品種‘紐荷爾’提前10～20 d，果實熟期比紐荷爾提前30 d以上[15]。研究表明，在果樹栽植培養過程中使其盡快開花，可使果實提早成熟[16]。因此，鑒定甜橙Dof基因家族成員，分析其進化和表達，以研究CsDof家族成員在甜橙早花誘導中的作用，對解析甜橙早花早結的分子機制提供重要啟示。隨著測序技術的發展，已從多個物種中鑒定出Dof基因家族成員，而至今鮮見甜橙基因組中Dof基因家族的鑒定及表達模式的報道。本研究利用Dof蛋白特征結構域Dof的隱馬爾可夫模型在甜橙基因組中進行HMMER分析，鑒定CsDOf基因家族成員;對其基因序列、基因結構、蛋白理化性質、系統進化關系和順式作用元件進行分析;通過qRT-PCR檢測2個甜橙品種CsDofs在不同成花時期的相對表達情況，為研究CsDofs參與甜橙開花的調控作用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試甜橙品種為‘贛南早’（Gannan Zao）和‘紐荷爾’（Newhall），由贛南師范大學國家臍橙技術研究中心提供。選取生長良好，長勢一致的2個甜橙品種‘贛南早’和‘紐荷爾’（樹齡為8年）花芽與葉片樣品進行對比試驗。分別于開花前120 d（T1）、90 d（T2）、60 d（T3）、30 d（T4）和0 d（T5）采集（3個重復）樣品。經液氮冷凍后置于–80 ℃低溫保存備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品RNA提取和反轉錄 ?Trizol法提取樣品RNA[17]，凝膠電泳檢測提取情況，紫外分光光度計測定濃度和純度，保留濃度范圍高于100 ng/μL且OD260/OD280大于1.8的RNA樣，使用反轉錄酶反轉錄合成cDNA，將其放入–20 ℃貯藏備用。

1.2.2 ?CsDof基因序列搜索及鑒定 ?在CPBD（http：//citrus.hzau.edu.cn/）中下載甜橙基因組數據。以擬南芥Dof基因[5]作為查詢序列，對甜橙蛋白序列進行BLASTp，期望值E-value<10-5檢索甜橙Dof基因家族成員，在Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）中下載Dof-family模型（PF02701），使用HMMER軟件對甜橙Dof蛋白進行搜索。此外，通過CDD（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd/term）、Pfam（http：//pfam.xfam. org/）和InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence/）鑒定CsDof基因的蛋白完整性及蛋白質結構域，剔除保守結構域不完整的基因。得到的甜橙Dof基因家族成員按照其在染色體的位置依次進行命名。

1.2.3 ?生物信息學分析 ?利用在線軟件EXpasy ProParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和ProComp（http：//linux1.softberry.com/）數據庫對CsDof基因的理生特性、亞細胞定位和蛋白親疏水性進行預測;運用SOPMA預測CsDof蛋白的二級結構;使用在線工具Map MG2C（http：// mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制CsDof基因在染色體上的分布圖;使用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS）軟件對CsDof基因結構圖進行可視化，同時使用MeMe分析軟件（http：//meme-suite. org/）對CsDof基因保守基序進行預測，設置預測motif數量為10，并繪制motif結構圖。通過MEGA 6.0軟件的鄰接法來構建擬南芥Dof蛋白和甜橙Dof蛋白的系統進化樹，bootstrapping設置為1000，其他均為默認值。提取轉錄起始位點上游2000 bp的序列作為CsDof基因的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子序列上的順式作用元件。

1.2.4 ?CsDofs組織表達分析 ?從CPBD數據庫中下載最新的甜橙愈傷組織、花、葉片和果實的轉錄組數據，獲取CsDofs相應的表達量，繪制CsDofs表達量熱圖。

1.2.5 ?實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 ?基于CsDofs在不同組織的表達分析結果，使用Beacon Designer 7軟件設計引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用2×SYBR Green PCR Mix試劑配置反應體系，檢測不同采集時間2個甜橙品種樣品中CsDof基因家族成員的表達情況，選用柑橘ACTB作為內參基因。使用Light-Cycler 480熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應。反應體系10.0 l： 2×SYBR Green PCR Mix 5.0 l，上、下游引物各0.5 l，cDNA模板2.0 l，ddH2O 2 l。擴增程序： 95 ℃預變性1 min;95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，?進行40個循環;95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min;40 ℃ 30 s。每個樣品3次重復。采用2–CT法計算qRT-PCR試驗結果，用SP-SS 19.0軟件對實時熒光定量數據進行方差分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?CsDof基因鑒定及命名

基于甜橙基因組，利用HMMER軟件比對搜索種子文件（PF02701），得到候選蛋白序列，經過CDD和Pfam數據庫驗證保守結構域，使用InterPro軟件對其進行確證，鑒定出24個甜橙Dof基因家族成員。根據CsDofs在不同染色體上的位置順序，命名為CsDof1～CsDof24（表2）。

2.2 ?CsDof蛋白理化性質分析、亞細胞定位

CsDof蛋白理化性質如表3。CsDof基因家族成員編碼的蛋白氨基酸數目為172～495，其中CsDof17最長，CsDof5最短;24個CsDof蛋白的等電點為5.24～9.37，CsDof9、CsDof12、CsDof13、CsDof14、CsDof16、CsDof17和CsDof19的等電點均低于7，為酸性蛋白，其余蛋白等電點高于7;分析表明24個CsDof蛋白均為親水蛋白，但其分子量差異較大，最大的CsDof18有54.75 kDa，最小的CsDof5僅19.36 kDa;除CsDof4為穩定蛋白，其他均為不穩定蛋白;脂融指數在44.2～ 66.23，原子總數在2660～7514。亞細胞定位預測表明大多數CsDof蛋白定位于細胞核，僅CsDof3、CsDof6、CsDof7和CsDof8蛋白定位在細胞外。

2.3 ?CsDof蛋白二級結構預測結果

由表4可知，24個CsDof蛋白的二級結構均以無規則卷曲為主，所占比例為51.5%～86.5%;β-折疊所占比例均最小，為1.03%～7.29%。

2.4 ?CsDof基因家族染色體定位分析

CsDofs在染色體上的位置如圖1。24個CsDof基因分別分布在甜橙的Chr1、Chr2、Chr3、Chr5、Chr6、Chr7、Chr8和ChrUn上，其中Chr1、Chr2和Chr5上分布數量最多，均為4個;其次是Chr6和Chr7，為3個;Chr3、Chr8和ChrUn上數量最少，各有2個。

2.5 ?CsDof基因家族結構及蛋白保守基序分析

從圖2所知，CsDof基因家族成員的基因結構相對簡單，CsDofs不含或僅含有1個內含子;CsDofs外顯子數量為1～2個。位于同一亞群的CsDofs具有相似的外顯子-內含子分布結構。A、C2.2和D2中的基因均含有1個外顯子;D1中除了CsDof5含有1個外顯子，其他CsDofs均含有2個外顯子。

在CsDof蛋白序列中發現10個保守基序（圖3），屬于同一亞群的CsDof蛋白保守基序的類型、數量和空間分布類似。Motif 1代表Dof結構域，所有CsDof蛋白都含有Motif 1;Motif 2、Motif 6、Motif 8和Motif 9僅分布在D1;Motif 4、Motif 5和Motif 10僅分布在C2.1。

2.6 ?CsDof基因家族系統發育進化分析結果

從圖4可知，甜橙（24個）和擬南芥（36個）共60個Dof蛋白被分為9個亞群，分別為A、B1、B2、C1、C2.1、C2.2、C3、D1和D2亞群。除C3亞群不含CsDof蛋白，其余各亞群都包含CsDof蛋白，這與CsDof蛋白進化樹的分組情況一致。D1亞群包含的CsDof蛋白個數最多，為5個;B2亞群次之，為4個;A亞群最少，僅有1個。

2.7 ?CsDOf基因家族順式作用元件分析結果

CsDofs啟動子區的順式作用元件分析結果如圖5，CsDofs啟動子序列主要包括光響應元件、激素響應元件、非生物脅迫響應元件和調節生長發育的響應元件。其中激素響應元件含生長素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、赤霉素響應元件、水楊酸響應元件和脫落酸響應元件;非生物脅迫響應元件包括干旱脅迫響應元件、低溫脅迫響應元件和參與應激反應響應元件;調節生長發育的響應元件中有分生組織表達響應元件和晝夜節律控制響應元件。在上述響應元件中光響應元件、生長素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件及低溫脅迫響應元件的數量顯著多于其他調控元件。說明CsDofs在響應光調控、逆境脅迫以及響應體內激素平衡過程中發揮重要作用，繼而推測其在控制甜橙成花時期中發揮作用。

2.8 ?CsDof基因家族在不同組織表達分析

利用甜橙的轉錄組數據繪制了CsDofs在愈傷組織、花、葉片和果實中的表達熱圖（圖6）。CsDof13、CsDof14和CsDof17在甜橙愈傷組織中高表達;CsDOf6、CsDof11、CsDof13、CsDOf17、CsDof19、CsDof21和CsDOf23在甜橙花和葉片中優勢表達，其中，CsDof19在花中的表達量高于其他組織;在甜橙果實中高度表達的基因有CsDof11、CsDof13、CsDof14、CsDof17、CsDof18、CsDof21和CsDof23。CsDof13和CsDof17在4個組織的表達均較高;CsDof11、CsDof21和CsDof23在花、葉片和果實中表達均較高。

2.9 ?CsDof基因家族表達特異性分析結果

使用qRT-PCR檢測‘贛南早’和‘紐荷爾’2個甜橙品種中CsDOf6、CsDof11、CsDof13、CsDOf17、CsDof19、CsDof21和CsDOf23的時空表達差異（圖7），7個CsDof基因在2個甜橙品種的花芽和葉片中均表達。各時期CsDof6、CsDof11、CsDof13、CsDof17和CsDof21在花芽和葉片中的相對表達量，對照品種‘紐荷爾’均高于早熟品種‘贛南早’，而CsDof19和CsDof23是‘贛南早’高于‘紐荷爾’。本研究推斷CsDofs可能具有調控甜橙成花時期的作用機制。

3 ?討論

3.1 ?CsDofs進化特性

通過統計分析發現Dof基因家族成員在不同植物中數量差異較大，如擬南芥有36個，番茄有34個，水稻則僅有30個[18]。本研究利用CPBD的甜橙基因數據庫對Dof基因家族進行了全面分析，共鑒定出24個CsDof基因家族成員。甜橙Dof家族成員之間外顯子-內含子分析存在較大的差異，CsDofs外顯子數量在1～3之間，有37%的CsDofs沒有內含子，基因結構相對簡單。這與擬南芥、水稻、小麥和黃瓜等植物的研究結果[8，19-20]相類似，表明Dof基因家族成員的基因結構在不同物種中高度保守，推測這些Dof蛋白可能具有相似的調控功能。同一亞群的大多數基因的保守基序分布模式相類似[21]，我們發現聚集在同一亞群的CsDofs有類似的保守基序類型、數量和順序。此外，保守基序1（Motif 1）存在于所有CsDofs，與擬南芥、水稻的研究結果[8]相吻合。

系統發育分析表明，CsDofs被分為8個亞群，而AtDofs被分為9個亞群。CsDofs未與C3亞群的AtDofs聚在一起;B1亞群含有3個CsDofs，5個AtDofs;甜橙中B2亞群含有4個CsDofs，擬南芥僅有3個AtDofs。這些結果表明，CsDofs和AtDofs經歷了不同的復制事件。此外，D1亞群含CsDofs和AtDofs的數量最多，與SiDofs[22]和MaDofs[23]中基因的聚集優勢相似。

3.2 ?CsDofs響應不同組織部位及不同開花期的表達分析

同一基因在同物種不同組織的表達情況存在差異，在不同物種的表達特性不同，具有組織表達特異性。研究表明，Dofs在黃瓜根、莖、葉子、雄花、雌花和卷須均有表達，但17個成員在根中有較高表達，其中CsaDof06、CsaDof13、CsaDof14、CsaDof17、CsaDof21和CsaDof23僅在根中表達，表明這6個基因可能在黃瓜根系發育中起著特定的作用[18]。OsDof11和OsDof30在水稻根、莖、葉、種和苗中均表達，但在葉中表達量最高，推測這2個基因可能參與水稻葉片的發育[1]。小麥中發現，Cluster I中的7個基因在葉片、莖和穗中表現出較高的表達水平，尤其是在發育早期。本研究對甜橙不同組織器官中的轉錄組數據分析表明，CsDofs在4個器官中均有表達。其中，大部分CsDofs在花朵和葉片中表達量較高，除CsDof17外的所有成員在愈傷組織中均較低表達，少部分在果實中表達較高。推測CsDofs在甜橙葉片、花朵、果實和愈傷組織各自發育過程中發揮一定的調控作用，但具體的功能機制需進一步研究。

花組織高表達的CsDofs在2個甜橙品種成花期花芽和葉片中5個不同時期均檢測到表達，發現同時期CsDof6、CsDof11、CsDof13、CsDof17和CsDof21在對照品種‘紐荷爾’花芽和葉片中均顯著高表達;而同時期的CsDof19和CsDof23在早熟品種‘贛南早’花芽和葉片中優勢表達。推測，CsDofs在調控甜橙開花周期中發揮重要作用。前人研究也表明，將AtCDF1超量表達會抑制擬南芥開花[18];轉OsDof12水稻在長日照條件下會提早開花[19]。本研究利用CPBD的甜橙基因數據庫對CsDof基因家族進行全面分析，為研究其調控開花時間的功能機制提供一定依據。在后續的研究中，應克隆花中高表達CsDof家族成員，分析其在成花周期下的表達模式，及通過調控該基因影響甜橙成花周期的分子機制。

4 ?結論

本研究使用生物信息學方法從甜橙基因組鑒定出24個CsDofs，預測其蛋白長度為在172～495，蛋白質分子量為在19.36～54.75 kDa，含10個保守基序。CsDofs被劃分為8個亞群，其成員可響應光調控和多重逆境脅迫。CsDofs具有組織表達特異性，部分CsDofs在甜橙花中高表達，但是高表達的CsDofs在不同花期甜橙品種的成花過程中瞬時表達又有差異，顯示CsDofs對甜橙成花起重要的調控作用。

參考文獻

[1] 周淑芬， 顏靜宛， 劉華清， 等. 水稻Dof基因家族的組織表達譜及脅迫誘導表達特征分析[J]. 分子植物育種， 2012， 10（6）： 635-643.

[2] 張煥欣， 李國權， 楊惠棟， 等. 甜瓜Dof家族全基因組鑒定與表達分析[J]. 園藝學報， 2019， 46（11）： 2176-2187.

[3] 成 ?亮， 劉寶玲， 劉 ?盼， 等. 青狗尾草Dof基因家族的全基因組鑒定及組織特異性表達分析[J]. 分子植物育種， 2018， 16（13）： 4226-4234.

[4] 琚龍貞， 趙 ?汀， 方 ?磊， 等. 陸地棉Dof基因家族的全基因組鑒定及分析[J]. 棉花學報， 2020， 32（4）： 279-291.

[5] Yanagisawa S. The Dof family of plant transcription fac-tors[J]. Trends in Plant Science， 2002， 7（12）： 555-560.

[6] Lijavetzky D， Carbonero P， Vicente-Carbajosa J. Genome- wide comparative phylogenetic analysis of the rice and Ara-bidopsis Dof gene families[J]. BMC Evolutionary Biology， 2003， 3（1）： 631-637.

[7] 蔡曉鋒. 番茄Dof基因家族全基因組分析及SlDof22、SlDHAR1和FaGalUR在AsA積累中的功能分析[D]. 武漢： 華中農業大學， 2014.

[8] 葛 ?敏， 呂遠大， 李 ?坦， 等. 玉米Dof轉錄因子家族的全基因組鑒定與分析[J]. 中國農業科學， 2014， 47（23）： 4563-4572.

[9] Fornara F， Panigrahi K C， Gissot L， et al. Arabidopsis DOF transcription factors act redundantly to reduce CONSTANS expression and are essential for a photoperiodic flowering response[J]. Developmental Cell， 2009， 17： 75-86.

[10] Corrales AR， Nebauer S G， Carrillo L， et al. Characterization of tomato cycling Dof factors reveals conserved and new functions in the control of flowering time and abiotic stress responses[J]. J Exp BotJournal of Experimental Botany， 2014， 65： 995-1012.

[11] He L， Su C， Wang Y C， et al. ATDOF5.8 protein is the up-stream regulator of ANAC069 and is responsive to abiotic stress[J]. Biochimie， 2015， 110： 17-24.

[12] Iwamoto M， Higo K， Takano M. Circadian clock-and phy-tochrome-regulated Dof-like Gene， Rdd1， is associated with grain size in rice[J]. Plant Cell Environ， 2009， 32： 592-603.

[13] Chen Y， Cao J. Comparative analysis of Dof transcription factor family in maize[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015， 33（5）： 1245-1258.

[14] 鐘八蓮， 賴曉樺， 楊斌華， 等. 紐荷爾臍橙芽變早熟品種——贛南早臍橙[J]. 中國南方果樹， 2013， 42（2）： 48-51.

[15] 易 ?龍， 夏宜林， 李雙花. ‘贛南早’與‘紐荷爾’臍橙對柑橘衰退病病毒變異的影響[J]. 園藝學報， 2017， 44（11）： 2179-2185.

[16] 江國良. 枇杷在四川不同生態型區的生態適宜性及調控技術研究[D]. 雅安： 四川農業大學， 2011.

[17] 慈曉彤， 石 ?辰， 王大瑋， 等. 云南栘[木衣]葉片總RNA提取方法的比較與改進[J]. 西北林學院學報， 2020， 35（03）： 95-99.

[18] 劉 ?俊， 金 ?鈺， 吳耀松， 等. 植物Dof基因結構特點及功能研究進展[J]. 生物技術通報， 2020， 36（10）： 180-190.

[19] Liu Y， Liu NN， Deng X， et al. Genome-wide analysis of wheat DNA-binding with one finger （Dof） transcription fac-tor genes： evolutionary characteristics and diverse abiotic stress responses[J]. BMC Genomics， 2020， 21（1）： 549-562.

[20] Wen CL， Cheng Q， Zhao LQ， et al. Identification and cha-racterization of Dof transcription factors in the cucumber genome[J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 23072.

[21] 牟藝菲. 小麥OPR和LOX基因家族的鑒定及其抗逆功能分析[D]. 楊凌： 西北農林科技大學， 2019.

[22] Cai X F， Zhang Y Y， Zhang C J， et al. Genome-wide Analy-sis of Plant-specific Dof transcription factor family in tomato[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（6）： 552-566.

[23] Feng B H， ，Han Y C， Xiao Y Y， et al. The banana fruit Dof transcription factor MaDof 23 acts as a repressor and inte-racts with MaERF9 in regulating ripening-related genes[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（8）： 2263-2275.

責任編輯：沈德發