全自動病理組織脫水機乙醇濃度的變化對組織塊的影響及應對措施

夏偉

常州市婦幼保健院病理科 （江蘇常州 213000）

全自動病理組織脫水機以處理標本量多、穩定好及安全性高等優點，一直以來得到了各醫院病理科和科研機構的認可[1]。一張優質的病理切片的產生需經過諸多環節的質量控制，病理組織脫水即為其中重要的環節[2]。組織塊在脫水機中的處理效果直接影響切片和染色質量以及免疫組化、原位雜交、二代測序等檢測結果[1，3-4]。乙醇是病理實驗室最常用的脫水劑，濃度過高或過低均會對組織處理產生不利影響，只有對乙醇濃度實施日常監測，并采取相應的措施，才可保證組織塊在每一個換液周期內的脫水質量，同時發揮試劑的最大效能，減少廢液排放，減輕維護保養人員的工作負擔[5]。基于此，本研究探討全自動病理組織脫水機乙醇濃度的變化對組織塊的影響及應對措施，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器設備：全自動封閉式病理組織脫水機（櫻花精機 株 式 會 社，SAKURA Tissue-Tek-VP1型 ）；40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%、80%～90%、90%～100%的乙醇濃度計（精度為0.1%，河北省衡水創紀儀器儀表有限公司）；1 500 ml 量筒。

標本：收集2019年3月至2020年3月常州市婦幼保健院的所有手術標本、活檢及內鏡標本。

試劑：10%中性緩沖甲醛溶液（廣州維格斯生物科技有限公司）；分析純無水乙醇、二甲苯（江蘇永豐化學試劑有限公司）；高效切片石蠟（熔點為58～60 ℃，上海華靈康復器械廠）。

1.2 方法

工作原理：櫻花全自動病理組織脫水機共16缸，第1～2缸為10%中性緩沖甲醛溶液，第3～8缸為不同濃度梯度的乙醇，依次從低濃度乙醇到純無水乙醇，第9～10缸為二甲苯，第11～14缸為液體石蠟，第15～16缸為清洗液，其中，第1～14缸容量均為3.50～3.75 L，第15～16缸容量均為5.00 L。

脫水處理時間及試劑更換如下。（1）脫水處理時間：第1缸10%中性緩沖甲醛溶液的處理時間為90 min，溫度設置為35 ℃；第2缸10%中性緩沖甲醛溶液的處理時間為120 min；第1、2、3～6缸乙醇的處理時間分別為90、70、60 min；兩缸二甲苯的處理時間分別為40 min 及35 min；四缸液體石蠟的處理時間分別為30、45、45及60 min；所有缸加壓/減壓（P/V）均打開。（2）試劑更換：將第1～2缸10%中性緩沖甲醛溶液倒掉，并更換新液體；將第1缸乙醇倒掉，清洗干凈并晾干，倒入無水乙醇放在第8缸，所有乙醇的缸前移一缸；將第9缸二甲苯倒掉，第10缸前移，并將第9缸更換新的二甲苯放在第10缸的位置；將第11缸的石蠟倒掉，依次前移后面3缸石蠟，第11缸倒入新的石蠟后放在第14缸的位置。

1.3 觀察指標

所有乙醇試劑的濃度均在20 ℃條件下進行檢測，先檢測每缸乙醇的基礎濃度，隨后每處理一批組織后，使用乙醇濃度計檢測每缸乙醇的濃度并記錄；分析所有組織塊HE染色切片的質量。

2 結果

2.1 組織塊脫水效果

在脫水機運行的第1～5次內，所有組織塊均脫水良好；第6次偶有組織脫水不良，主要為淋巴結、乳腺組織，制片時易化開；第7次部分組織塊脫水不良，主要為宮內膜及少量胎盤組織等，制片破碎，切完后的石蠟組織中央區內陷，其余小組織塊均未見明顯異常。

2.2 一個換液周期內乙醇濃度的變化

在一個換液周期內，第1缸乙醇濃度降低最快，第2缸乙醇濃度降低次之，第3～6缸乙醇濃度變化量依次減小，見表1。

表1 換液前后乙醇濃度變化（%，±s）

表1 換液前后乙醇濃度變化（%，±s）

項目 換液后 換液前 變化量第 1 缸 78.5±1.8 52.3±3.2 31.9±2.1第 2 缸 90.7±0.9 81.3±2.3 12.2±1.6第 3 缸 95.5±0.6 92.0±1.0 4.9±0.9第 4 缸 97.8±0.4 96.3±0.6 2.6±1.2第 5 缸 99.3±0.3 98.3±0.4 1.7±0.5第 6 缸 99.9±0.1 99.6±0.3 0.7±0.3

2.3 一個換液周期內組織塊總數及脫水次數

一個換液周期內共處理（1 015±107）個組織塊，組織脫水機運行（6±1）次。

2.4 組織塊HE 染色質量

于顯微鏡下觀察HE 切片，細胞核著色清晰、核漿對比明顯、染色鮮艷，不影響病理診斷。

3 討論

階梯替換法與分組替換法是大多數實驗室常用的換液方法，旨在使乙醇保持一定的濃度梯度，置換組織內的游離水，為透明、浸蠟提供條件，保證細胞形態、組織結構不被破壞，便于切片及后續檢查等[6]。本研究通過對多個周期的乙醇濃度進行檢測，得出乙醇濃度在一定范圍內變化，可保證組織脫水質量穩定。

本研究通過檢測多個周期內所有缸乙醇的濃度，發現第1、2缸乙醇的濃度變化幅度較大，聯合分析第1～2缸的乙醇濃度數據，有利于判斷脫水機的換液時機，監測組織塊的脫水質量。本研究發現，當第1缸乙醇的濃度接近50%時，按照原來的脫水程序會出現部分大塊組織脫水不良的現象，與文獻報道結果類似[7]；當第1缸乙醇的濃度降低到50%附近時，第2缸乙醇的濃度接近80%，提示需對脫水機進行乙醇更換；當組織塊數≤150個時，通過縮短低濃度乙醇的脫水時間，適當延長高濃度乙醇的脫水時間及二甲苯的透明時間，實驗觀察發現，組織脫水、透明、制片、染色均無顯著差異；當組織塊數＜150個且均以小組織塊為主時，通過換液后處理發現，組織塊明顯質地較硬、脆，制片困難，個別組織的脫水效果不佳。經分析，其原因可能為濃度高的乙醇溶液脫水過快導致大組織塊表面硬化，影響乙醇的滲透、置換，導致組織塊內水分未能完全置換出來，組織透明、浸蠟不良[7-9]。本研究還發現，大組織塊如宮內膜、乳腺、胃腸等組織，在臨近換液時易發生脫水不徹底的現象，造成切片易化開，制片困難，切完片后組織蠟塊凹陷，原因可能為組織塊體積大、取材厚，當乙醇濃度過低時，通過充分置換后的組織內仍殘留較多的低濃度乙醇，經過梯度乙醇脫水后，組織內的水分未能充分置換，二甲苯與水不互溶，導致組織透明、浸蠟不能完成，組織蠟塊水分揮發最終出現蠟塊中心組織凹陷，因此，當第1缸乙醇濃度降低到50%附近，且組織塊數量＞150個，含有較多的含水脂肪等大組織塊時，按照階梯替換法進行換液后再作標本處理，組織塊均處理良好，無明顯異常；當嘗試通過縮短低濃度乙醇的脫水時間，適當延長高濃度乙醇的脫水時間時，組織塊脫水不良。當第1缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度≤80%時，換液后處理組織塊，組織塊脫水均未見明顯異常，因此，當需更換試劑時，有必要參考最前面兩缸的乙醇濃度，按照實驗方法進行換液。

現將以上情形總結如下：（1）當第1缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度≤80%時，若組織塊數量≤150個，則選擇換液后處理或調整脫水程序后處理并且在下次脫水前換液；（2）當第1缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＜80%時，若組織塊數量＞150個，則選擇換液后處理標本；（3）當第1缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＞80%時，若組織塊數量＜150個，則調整脫水程序后處理標本并且在下次脫水實驗前測量第2缸乙醇的濃度，若第2缸乙醇的濃度仍＞80%，且標本量＜150個，則按（1）操作，若組織塊數量＞150個，則選擇換液后處理標本；（4）當第1缸乙醇濃度接近50%，第2缸乙醇濃度＞80%時，若組織標本量＞150個，則選擇換液后處理標本。

綜上所述，通過對乙醇濃度進行日常檢測，發現了每缸乙醇濃度在每個換液周期內的變化規律，并及時調整程序、更換新液，保證了每批組織塊的脫水質量；通過對乙醇濃度尤其是前兩缸乙醇的濃度進行定期檢測，有效把控了換液時機，保證了合理的乙醇濃度梯度。不同的實驗室，其組織類型、數量不盡相同，脫水機種類、脫水程序也有所差異，建議各實驗室在條件允許的情況下，通過參考本實驗的方法選擇恰當的換液方法及換液時機。