慢性熱應激對放牧肉牛血液生化指標、抗氧化能力及免疫功能的影響

陳 浩 王純潔 斯木吉德 張 晨 武思同 徐 萍 曹佳明 劉飛鴻 敖日格樂*

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學 獸醫學院，呼和浩特 010018)

當動物產生的熱負荷超出其散熱能力時，機體所做出非特異性反應總和被稱為熱應激[1]。隨著全球氣候變暖和養殖業集約化程度的加大，熱應激給畜牧業生產和經濟發展造成了巨大的損失。Ferreira等[2]研究指出熱應激對美國奶牛產業每年造成了近20億美元的損失；還有學者報道高溫高濕環境所引發的熱應激導致發展中國家養殖業的生產效率下降25%[3]。根據應激的強度和持續時間可分為急性和慢性熱應激，急性熱應激通常強度較大，持續時間為3～24 h；而慢性熱應激的應激強度較為溫和，且持續時間較長；通常由季節變化所引起的較溫和的熱應激屬于慢性熱應激，持續時間較長且在畜禽養殖生產中普遍發生。大量學者通過比較不同季節家畜生產性能的差異研究發現，與冬、春兩季相比，夏季高溫高濕環境可造成奶牛乳品質顯著下降、繁殖性能降低以及疾病發生率升高等危害[4-5]。

當動物遭受應激時，其機體內分泌系統可通過多種激素調控機體的生理功能以維持內環境的相對穩定。有研究發現處于熱應激狀態下的奶牛甲狀腺機能減退以減少機體產熱[6]。黃牛遭受熱應激侵襲時，其甲狀腺激素分泌量顯著降低[7]。當環境溫度達到35 ℃時，奶牛血清中的甲狀腺激素含量顯著降低65%，極大降低了用以維持機體正常生理活動的甲狀腺機能[8]。此外，熱應激還可引起動物機體內自由基增多，破壞體內的抗氧化酶系統平衡，進而導致抗病力下降引發各種病理癥狀。據研究報道熱應激可導致山羊的免疫功能和抗氧化能力顯著下降[9]。也有研究表明熱應激狀態下肉雞的抗氧化能力和平均日增重均顯著下降[10]。目前，國內有關家畜熱應激的研究主要集中于南方高溫高濕環境所造成的嚴重熱應激。董曉霞等[11]研究發現北京地區的奶牛每年有130 d以上處于熱應激狀態；徐明等[12]通過研究呼和浩特地區奶牛舍內溫濕度年度變化規律，結果顯示全年內奶牛共有144 d處于熱應激期。

內蒙古草原夏季常出現極端高溫天氣，局部地區最高氣溫可超過40 ℃，而放牧肉牛在無遮陰處的草原上，極易遭受熱應激的侵襲[13]。但目前關于內蒙古地區反芻動物熱應激的研究多數集中于奶牛和羊，研究表明，熱應激導致奶牛和羊的采食量下降，進而引起營養代謝病發病率升高并降低其生產性能，尚未有內蒙古地區肉牛熱應激的相關研究。因此，本研究以放牧西門塔爾母牛為試驗對象，探討慢性熱應激對放牧條件下西門塔爾母牛血液指標、免疫指標及抗氧化指標的影響，旨在為夏季放牧肉牛熱應激相關研究提供數據支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗在內蒙古自治區赤峰市阿魯科爾沁旗巴彥溫都爾草原的牧戶家庭牧場進行，選取20頭體況相近的健康西門塔爾母牛，全部試驗牛均在同一天然草場自然放牧(牧草營養成分見表1)，自由飲水(草場內有天然河流)。試驗分為熱應激期(2019年7月15日—8月5日)和熱應激恢復期(2019年8月6日—8月25日)2個階段。

表1 放牧草場牧草養分

1.2 綜合指數(CCI)測定

本次試驗是以在天然草場全年自然放牧的肉牛為研究對象，所測的環境指標均為草場自然環境中的溫度和相對濕度。試驗期間，測定每天8:00、14：00 以及20:00時放牧草場的溫度、相對濕度和風速，記錄日照時間并根據Mader等[14]提出的綜合指數(Comprehensive climate index, CCI)計算公式計算牧場的CCI：

CCI=T+RH+WS+RAD

式中：T為環境溫度，RH為環境濕度校正數，WS為風速校正數，RAD為輻射校正數。

1.3 血清制備和血液生化指標測定

分別于試驗期的最后一天清晨出牧前，頸靜脈采集所有試驗牛非抗凝血10 mL，室溫靜置0.5 h后 3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液分裝至 1.5 mL 離心管中，分離出的血清立即置于液氮罐中保存，帶回實驗室于-20 ℃冰箱中保存待測定。甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸、生長激素、胰島素樣生長因子、尿素氮、葡萄糖、胰島素和胰高血糖素含量檢測試劑盒購自北京華英生物技術研究所；總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛以及免疫球蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定過程均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計分析

試驗數據由Excel 2010處理后，采用SPSS 19.0軟件進行配對樣本T檢驗(Student’s T test)，并進行顯著性檢驗，以P<0.05為差異顯著性標準，結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 牧草營養成分和綜合指數測定結果

由表2可知，在試驗第一階段草場最高溫度達到39.60 ℃，平均溫度為30.40 ℃，CCI在此期間平均高達38.77，表明此階段的西門塔爾牛遭受熱應激侵襲；而試驗第二階段草場最高溫度為28.60 ℃，平均溫度為20.30 ℃，CCI為23.63，均未達到肉牛產生熱應激的臨界值；且根據表1顯示試驗期間牧草營養成分無顯著變化，符合試驗要求，可進行西門塔爾牛免疫及抗氧化功能的比較研究試驗。

表2 不同試驗期草場溫濕度及CCI

2.2 慢性熱應激對放牧牛血液生化指標的影響

慢性熱應激對放牧牛血清激素的影響見表3。由表3可知，慢性熱應激導致放牧牛平均日增重顯著降低，且對放牧牛血清激素含量有顯著影響。與熱應激恢復期相比，熱應激期牛血清T3、T4、GLU、INS和IGF-1含量顯著降低(P<0.05)；熱應激狀態下放牧牛血清中BUN含量有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；GH和GC含量在熱應激和熱應激恢復期差異不顯著(P>0.05)。

表3 西門塔爾牛血清激素測定

2.3 慢性熱應激對放牧牛抗氧化指標和免疫指標的影響

由表4和表5可知，慢性熱應激對放牧牛血清抗氧化指標和免疫指標有顯著影響。與熱應激恢復期相比，T-AOC、SOD活性和血清中IgA、IgG、IgM和IL-2含量顯著降低(P<0.05)；熱應激期牛血清 IL-1β、IL-6和MDA含量顯著增加(P<0.05)；而 IL-4 含量和GSH-Px活性在熱應激和熱應激恢復期差異不顯著(P>0.05)。

表4 西門塔爾牛血清抗氧化指標測定

表5 西門塔爾牛血清免疫指標測定

3 討 論

3.1 慢性熱應激對肉牛血液生化指標的影響

肉牛熱應激是由環境溫度、濕度、空氣對流及自身產熱等多種因素引起，其中環境溫濕度是最主要的影響因素，因此綜合環境溫濕度、風速及日照時間的CCI是判斷放牧條件下肉牛是否遭受熱應激的重要指標[15]。一般認為當CCI>25時肉牛處于熱應激狀態；奶牛生產的可適應溫度范圍為-0.5～20.0 ℃，肉牛生長適宜溫度是5～25 ℃[16-18]。本試驗研究結果顯示，試驗前期草場平均溫度為30.40 ℃，CCI達到28.77，已超出牛產生熱應激的臨界值，試驗牛處于熱應激狀態；同理放牧牛在試驗后期處于非應激狀態。本試驗根據熱應激反應的持續時間，判定試驗前期為慢性熱應激期。

T3和 T4在動物機體能量代謝和生長發育過程中具有重要的作用[19]。何欽等[20]研究表明，熱應激狀態下奶牛血清中T3和 T4濃度顯著下降，并導致營養物質消化率和乳品質降低；LARA等[21]通過研究慢性熱應激狀態下肉雞生產性能的變化，發現慢性熱應激顯著降低了肉雞的生產性能和血清中T3和 T4濃度，與本試驗結果一致，這表明慢性熱應激可導致放牧肉牛機體代謝能力降低，減少機體產熱以適應高溫環境。此外，本研究發現熱應激狀態下放牧肉牛血清中IGF-1含量顯著降低，這可能由高溫環境下機體代謝水平的下降所引起的。血清中BUN是蛋白質代謝的終末產物，其含量的高低可反映動物生長發育和營養狀況[22]。Ikuta等[23]研究發現，奶牛血清中BUN含量和溫度的升高呈顯著正相關，這可能由高溫環境下肉牛食欲降低、采食量下降導致其無法獲取足夠能量，氨基酸代謝加強導致血清中BUN升高。熱應激狀態下放牧肉牛血清BUN含量有升高的趨勢，但差異不顯著，這可能由動物遭受慢性熱應激時，機體仍以糖類和脂肪分解為機體功供能。有學者研究發現動物血清GLU含量隨環境溫度的升高而降低[24-25]。血液中的GLU可通過氧化釋放或轉化能量方式為動物機體供能調節其生命活動；INS是由胰島B細胞分泌的一類可調節GLU合成和轉化作用的蛋白質激素[26]。本試驗研究結果顯示熱應激狀態下肉牛血清中GLU和INS含量均顯著下降，這可能是由于母牛機體為調節血糖濃度而減少了INS的分泌量。

3.2 慢性熱應激對西門塔爾牛抗氧化能力的影響

動物機體自身具有廣泛的抗氧化防御機制，T-AOC、GSH-Px及SOD均是酶促體系中的主要抗氧化酶[27]。GSH-Px可通過清除體內過多的自由基以抑制機體脂質過氧化；SOD是機體內一種重要的抗氧化酶，在清除自由基和防止生物大分子損傷等方面具有重要作用；T-AOC代表機體防御體系的抗氧化能力[28-30]。由于抗氧化酶系統在不斷地清除體內產生的自由基，因此自由基的產生和清除處于動態平衡中，從而保護機體在正常生長代謝過程中免受氧化應激損傷；若機體內的自由基不能被及時清除，體內積累的大量自由基可通過破壞細胞的結構和功能，使生物膜中的不飽和脂類發生脂質過氧化并形成脂質過氧化物，其最終產物即是MDA，因此其含量可間接反映自由基產生的情況和組織細胞的損傷程度[31]。動物機體生物膜功能一旦遭到破壞，將進而損傷蛋白質及核酸等生物大分子，導致機體代謝功能發生紊亂。當動物遭受應激時，其抗氧化酶系統平衡被打破，機體需耗費大量的抗氧化酶進行消除過多的自由基[32]。據研究結果表明，在遭受慢性熱應激侵襲時，山羊血清SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性顯著下降，且MDA含量增加[33]。在肉牛研究中也發現，夏季肉牛血清中的抗氧化酶活性極顯著低于春季[34]。白丹丹[35]通過研究季節變化對三河牛機體抗氧化能力的影響，也得出了類似的結果。本研究發現，熱應激狀態下西門塔爾牛血清中MDA含量相比于熱應激恢復期顯著升高，T-AOC和SOD活性顯著降低，這與前人的研究結果一致。由于熱應激可以導致誘導機體內自由基的產生量增加，為清除體內產生的過多自由基，西門塔爾母牛血清中GSH-Px和SOD被大量消耗，進而加快機體組織的脂質過氧化，導致其終產物MDA含量顯著升高，西門塔爾母牛體內抗氧化酶系統平衡因此被打破，導致其T-AOC顯著下降，這些結果均表明慢性熱應激對西門塔爾母牛機體造成了一定的氧化損傷。因此，在夏季放牧草場中需要為放牧肉牛提供維生素[36]及礦物質[37]舔磚供肉牛舔食，以緩解高溫侵襲所導致的肉牛抗氧化能力下降。

3.3 慢性熱應激對西門塔爾牛免疫功能的影響

免疫球蛋白是一類當動物受到抗原刺激后產生的用以清除抗原的球蛋白，IgA、IgG和IgM可在機體特異性免疫中發揮重要作用[38]。Wu等[39]研究發現動物機體內免疫球蛋白的含量可能取決于應激強度、持續時間以及動物品種和體況。據研究發現，不同持續時間的熱應激均可導致山羊血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這表明在高溫環境下，山羊機體的免疫功能受到抑制，嚴重損害了其體液免疫[9,33]。此外，熱應激可導致肉牛血清中IgG含量顯著下降[40]。本研究表明，西門塔爾母牛在慢性熱應激期間血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這與上述研究結果一致，表明慢性熱應激抑制了肉牛的體液免疫功能。

IL-2 是一種主要由活化的T淋巴細胞產生的多效性細胞因子,具有廣泛的生理與病理效應，可促進T細胞增殖分化，增強T細胞和NK細胞活性，機體內IL-2含量的多少可以間接反映出機體的免疫應答水平[41]。IL-4可誘導B細胞成熟并刺激其產生免疫球蛋白，對體液免疫具有重要調節作用[42]。有研究表明，慢性熱應激狀態下，山羊血清中IL-2含量有下降的趨勢[33]。本研究發現，熱應激狀態下西門塔爾母牛血清中IL-2含量顯著低于熱應激恢復期，與馬燕芬等[40]研究結果一致，表明慢性熱應激可能降低了動物機體的免疫應答。然而大量關于急性熱應激對畜禽血清IL-2水平的影響結果表明，急性熱應激可導致血清IL-2含量顯著增加[43-44]。這表明IL-2含量可能與熱應激的持續時間相關，有必要設置不同梯度的熱應激持續時間進行深入研究。Peli等[45]研究表明，肉牛在遭受慢性熱應激侵襲時血清中IL-4含量顯著升高，也有研究發現，慢性熱應激狀態下肉牛血清IL-4含量無顯著變化[46]。本研究發現，熱應激狀態下西門塔爾牛血清中IL-4含量有下降的趨勢，與上述結果熱應激狀態下動物血清中IL-4含量變化不一致，這可能與試驗動物的品種或熱應激狀態下試驗動物所處環境不同有關，有必要進行深入研究。促炎細胞因子IL-1β和IL-6的少量分泌可局部作用于免疫細胞，增強免疫反應，以緩解應激對機體造成的損傷，但過量分泌可造成組織損傷進而損害機體的免疫功能[47-48]。本研究表明，在遭受熱應激侵襲時，肉牛血清中IL-1β和IL-6含量均顯著增加，這與前人的研究結果一致。急性或者慢性熱應激均可導致畜禽血清IL-1β和IL-6含量顯著增加，這可能是由于免疫細胞細胞膜中的不飽和脂肪酸對機體氧化應激高度敏感，因此，當免疫細胞受到氧化應激后免疫功能下降，進而導致動物機體發生了炎癥反應[49-50]。

4 結 論

慢性熱應激降低了放牧肉牛的免疫功能和抗氧化能力，對肉牛機體造成了一定的損傷；慢性熱應激對放牧肉牛的內分泌激素水平有較大的影響，表明肉牛可通過內分泌系統自身調節來提高機體對熱應激的適應能力。