油松組織培養及再生體系建立研究

費昭雪， 劉莉麗， 侯 娜， 彭少兵

(1.西北農林科技大學林學院， 楊凌 712100； 2.貴州省林業科學研究院， 貴陽 550005)

油松(PinustabulaeformisCarriere.)為松科松屬常綠喬木，樹高可達30 m以上，胸徑可達1 m[1]。油松適應性強，廣泛分布于我國東北、西北、華中、西南等地區[2-4]。油松材質致密耐用，是建筑、造船及家具等的良好用材[5-8]。油松的用途廣泛，市場需求量逐年增加，野生資源已經難以滿足需求，主要依靠人工種植，因此，油松苗木供應亟待一種快速繁殖的方法。植物組織培養技術具有高效快速、遺傳穩定的優點成為了油松繁殖的有效途徑[9-11]。試驗以油松組織培養關鍵技術為核心進行研究，旨在為相關的生產研究提供一定的依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

于2018年春季采集一年生健壯、無病蟲害的油松嫩枝作為外植體，在洗潔精水中漂洗3～5 min，洗去材料表面的泥土和灰塵，然后用自來水進行流動沖洗，時間30 min[12]。清洗中修剪過長或過大枝條，隨后用75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min，最后用無菌水沖洗3～5次。

1.2 實驗方法

1.2.1外植體預處理1.2.2油松外植體的芽分化培養

研究油松的分化，可以為遺傳體系建立和多倍體等實驗做鋪墊，另外，快速繁殖還能夠縮短育種周期，提高藥用成分的含量。實驗以MS為基本培養基，加入30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實驗法設計6-BA、TDZ和NAA 三種激素的不同濃度和配比，添加到培養基中[13-16]。分裂素(6-BA)設置濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，TDZ設置濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg·L-1，生長素(NAA)設置濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg·L-1。按照正交試驗設計9組不同激素濃度配比和1組空白對照處理。實驗所用材料為健壯無菌苗，莖段(不帶葉腋)切成長約1 cm，平鋪于培養基中，每瓶4枚，每組10瓶，重復3次。培養條件同上。在培養期間定期觀察并做好分化率和生長情況的記錄。

1.2.3油松外植體的芽增殖培養

實驗在MS培養基的基礎上，輔以蔗糖(30.0 g·L-1)，瓊脂(5.0 g·L-1)，以6-BA、TDZ和NAA三種激素濃度及配比為影響因素，采用正交實驗進行設計。分裂素6-BA設0.1、0.3、0.5 mg·L-1等3個濃度，TDZ設0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個濃度，生長素NAA設0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個濃度。選取消毒備用的材料，切取長約1 cm帶葉腋的莖段和長約2 cm的頂芽。莖段平鋪于培養基表面，每瓶4枚，每組10瓶，重復3次；頂芽插入培養基，每瓶4株，每組10瓶，重復3次。培養條件同上。在培養期間定期觀察并做好增殖情況、平均苗高和生長情況的記錄。

1.2.4油松不定芽生根培養

以1/2 MS(大量元素及鈣鹽用量減半，其余母液用量不變)為基本培養基，附加30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實驗設計研究IBA、NAA 2種激素的不同濃度和活性炭添加量對油松生根的影響。生長素(IBA)和NAA濃度梯度均為0.1、0.2、0.3 mg·L-1，活性炭設0.1、0.2、0.3 g·L-1等3個濃度。實驗選取健壯的無菌苗為材料，切取長約2 cm的頂芽接入培養基中，每瓶4株，每組10瓶，重復3次。培養條件同上。在生根培養期間定期觀察并記錄生根情況，統計生根數和測量根長。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0、Excel 2007軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對油松芽分化的影響

不同培養基對油松莖段的分化有明顯影響。從表1可以看出，用油松的莖段來分化，對照組處理(ck)分化芽數最低，為0；8號組合的分化芽數最高，為3.67。但是8號處理組合的油松長勢欠佳，有的出現玻璃化現象，不利于后期的繼代繁殖。其中4號處理組合和6號處理組合雖然不是分化芽數最高的，但是其苗高和生長情況在本實驗中是最好的，且無玻璃化現象。4號處理組合的分化芽數(3.49)比6號組合的分化芽數(3.15)高。綜上所述，4號處理組合為油松莖段最佳分化培養基，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

表1 不同培養基對油松莖段分化的影響

2.2 不同培養基對油松芽增殖的影響

2.2.1不同培養基對油松莖段芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對油松莖段的增殖效率有明顯影響(圖1)。從表2可以看出，沒有添加激素的組合(ck)增殖系數最低，為1.75。A 2號處理組合的增殖系數為5.33，是實驗組合中增殖系數最高的，并且增殖的植株長勢粗壯。雖然A 4號處理組合培養基增殖的植株長勢粗壯，且增殖系數達4.00，但其平均苗高為3.0 cm，較A 2號處理組合的低。A 1號和A 6號處理組合增殖系數也到達了4.00，但是長勢不如A 2號處理組合，且存在一定的玻璃化現象。綜合評定，A 2號處理組合的增殖系數、平均苗高、生長情況是實驗組合中最好的，綜上所述，油松帶葉腋莖段的最佳增殖培養基為A 2號處理組合MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

注：A為外植體；B、C為愈傷組織；D為油松芽。

表2 不同培養基對油松莖段增殖的影響

2.2.2不同培養基對油松頂芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對油松頂芽的增殖有明顯影響。從表3可知，以油松頂芽進行增殖，對照處理(ck)增殖系數最低，為1.33。A 8號組合的增殖系數最高，為4.67。但是A 8號組合的油松長勢欠佳，存在一定比例的玻璃化現象，不利于后期的繼代繁殖。其中A 4號組合和A 6號組合雖然不是增殖系數最高的，但是其苗高和生長情況在本實驗中均是最好的，且無玻璃化現象。A 4號組合的增殖系數(4.29)比A 6號組合的增殖系數(4.00)高，綜上所述，油松頂芽的最佳增殖培養基為A 4號組合MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。

表3 不同培養基對油松頂芽增殖的影響

2.3 生根培養

在生根培養的30 d里，不同時間段植株生根株數不同，在第10～15天生根植株增加得最多，平均為11株，第15天后生根的株數逐漸減少。分析其原因為油松需要萌發根原基才能順利完成生根，其生根方式為愈傷組織生根。不同的單株所需形成愈傷組織的需求不同，導致某些植株會優先長出根，導致植株生根株數出現不規則遞增的現象。

試驗的總平均生根率為66.7%，由表4可看出，對照組(ck)的生根率最低，而B 1～B 9號處理組合的生根率為58.3%～91.7%，可以得出油松在激素的誘導下易于生根，無激素生根較困難。B 1～B 3，B 4～B 6，B 7～B 9號處理組合中生根率有下降的趨勢，以3個編號為一組進行分析，可以發現， 在IBA濃度保持不變的情況下，生根率隨NAA濃度升高呈下降趨勢，生根率最高的是B 7號處理組合(91.7%)，平均根長最長，為0.6 cm，然其苗高最低，為3.1 cm。分析原因為較高濃度的IBA和較低濃度的NAA對油松生根有良好的促進作用，因其有良好的誘導生根效果，但對植株營養器官的生長效果有所減弱，導致植株高度總體偏低。就活性炭添加量而言，B 1、B 6、B 8號處理組合活性炭添加量為0.1 g·L-1，其平均生根率最低，為66.7%；B 2、B 4、B 9號處理組合活性炭添加量為0.2 g·L-1，其平均生根率為77.8%； B 3、B 5、B 7號處理組合活性炭添加量為0.3 g·L-1，其平均生根率為77.8%。因此，活性炭添加量在0.2～0.3 g·L-1范圍內時可促進生根。綜上，活性炭作為油松最佳生根培養基為B 7號處理組合。即1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1。

表4 油松生根數據統計

3 結論與討論

3.1 結 論

油松嫩枝優化后的分化培養基是MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。其誘導分化率達4.49%，誘導分化的不定芽顏色濃綠，長勢較粗壯。

帶腋芽油松莖段組織培養增殖生長最佳培養基為MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數達5.33；油松頂芽組織培養增殖生長最佳培養基為MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。在此條件下增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數達4.29。1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1活性炭為油松生根的最佳培養基。此條件下植株生長粗壯，生根條數在5條左右，生根率達91.7%。

3.2 討 論

MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA培養基能夠較好地呈現油松組織生長情況，可作為增殖生長的最佳培養基，在此條件下增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數為4.29。實驗中也對B 5培養基對油松的增殖效果進行了研究，結果顯示，在MS培養基的增殖效果普遍好于B 5培養基。試驗中還發現，選用油松莖段為材料進行增殖時，會逐漸膨大產生愈傷組織，培養一段時間后，愈傷組織開始分化出綠色的芽點，隨后分化出芽，因此認為，油松更適合于通過產生愈傷組織來增殖擴繁。

實驗還發現，適宜的培養基種類和激素配比對組織培養過程中誘導分化、增殖培養和生根培養均有促進作用。有學者也得到類似的結論[16]。在試驗中也證明了這一點，加激素的處理組明顯比未加激素的對照組的效果好。此外，在培養過程中，會出現增殖植株玻璃化的現象。引起試驗材料玻璃化是由于滲透勢不均衡造成的，當植物體內的滲透勢低于培養基較多時，植物組織會從培養基中大量吸水，來促使兩側的滲透勢接近。結果導致培養的材料水分含量較高，呈現一種透明或半透明的狀態，稱之為玻璃化現象[17]。玻璃化的植株長勢弱，不能用作進一步增殖和生根的材料，對實驗結果也有一定的影響。在培養過程中發現，不能完全凝固的培養基中容易出現玻璃化現象，一些激素濃度的配比也會導致一定程度的玻璃化。綜合分析來看，導致玻璃化現象的因素較多，比如培養材料、培養環境、培養基成分、繼代次數、植物激素等，但是在所查閱的文獻中未見到對油松組織培養實驗中玻璃化現象的講述。