宮內暴露于高雄激素對小鼠胎盤營養轉運體表達的影響*

王 鑫，陳書強，金 妮，董 杰，雷 輝，王曉紅

空軍軍醫大學第二附屬醫院婦產科，陜西西安 710038

多囊卵巢綜合征(PCOS)是臨床上發生率較高的代謝、內分泌疾病，以排卵障礙、高雄激素血癥為主要特征，表現為月經周期不規律、不孕及多毛等[1-2]。臨床研究表明，PCOS病因復雜，多數患者發病是在多基因遺傳易感性基礎上形成，由各種不良環境因素誘發[3]。國外學者研究表明，機體生長是一個較為復雜的過程，常受到激素的持續刺激，導致其生理、代謝異常[4]。動物實驗結果表明，動物娩出前持續暴露在高雄激素中，能引起胎兒產生雄激素化特征，能增加高雄激素血癥發生率[5]。胎盤是妊娠期特殊的器官，承擔了未成熟胎兒所有器官功能，但是胎盤較為脆弱，其功能發揮受到較多因素的影響[6-7]。胎盤特需的營養物質的轉運體表達水平下調，會影響胎兒宮內的生長發育，導致胎兒出現低出生體質量[8]。因此，本研究以小鼠作為研究對象，探討宮內暴露于高雄激素對小鼠胎盤營養轉運體表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇2018年1-3月購置的6～8周齡ICR雌性小鼠,體質量30～40 g,實驗組7只，對照組6只，與雄鼠1∶1合籠，自然受孕，動物合格證號：SCXK(陜)2017-003。所選動物均購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，自由飲水、進食，自然光照，飼養溫度20～23 ℃，飼養環境濕度40%～60%。

1.2主要藥品與試劑 脫氫表雄酮(DHEA)購自美國ApexBio公司；RNA 的抽提采用TRIzol試劑，購自美國 Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑均購自日本 TaKaRa 公司；PCR引物由中國上海生物工程有限公司合成。

1.3主要儀器與設備 PCR儀、CFX96實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；全波長酶標儀購自美國MD SpectraMax公司；ND2000分光光度計購自美國Thermo公司；高速離心機購自北京中原合聚經貿有限公司，超低溫冰箱購自Beckman公司，水平電泳儀購自北京中原合聚經貿有限公司，凝膠成像系統購自上海生物工程有限公司。

1.4方法

1.4.1干預方法 對照組：從孕6.5 d開始每天經頸部皮下注射單純玉米油0.2 mL。實驗組：給予頸部皮下注射DHEA油劑(60 mg·kg-1·d-1)，連續并均完成12.5 d干預，第18.5天干預完畢后以頸椎脫臼法處死，收集胎鼠及胎盤標本。

1.4.2目的基因mRNA表達測定 (1)RNA的分離、提?。簩⑻ケP轉入2 mL玻璃組織的勻漿器中，加入2 mLTRIzol試劑，充分混合均勻后室溫放置5 min，使其充分裂解，勻漿液分別移入2個1.5 mL EP管中，于4 ℃下高速離心機中12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，留上清液。加入200 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相，至另一離心管中；加入等體積的異丙醇(至少50 μL)，混勻，室溫放置5～10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，RNA沉淀于管底；加入100 μL 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4 ℃ 8 000×g 離心5 min，盡量棄去上清液，室溫晾干5 min(目測晾干)，其中一管用75%乙醇保存，另一管用30～50 μL 水溶解RNA樣品。(2)反轉錄：嚴格按照反轉錄試劑盒說明書體系要求以及反應條件要求操作，每組標本取 1 μL RNA標本加至 20 μL體系中進行反轉錄反應，反應條件為25 ℃ 10 min、42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，4 ℃保存，從而獲得cDNA。(3)目的基因mRNA表達水平測定采用實時熒光定量PCR技術，引物序列為PrimerBank 上所查的序列，由上海生工生物工程有限公司合成，目的基因及內參GAPDH的引物序列見表1。建立反應體系如下：熒光染料SYBR Green Master Mix(2×)10 μL，滅菌蒸餾水6 μL，PCR 正向引物1 μL、反向引物1 μL，cDNA模板2 μL，總體積為20 μL。每份標本均設3個平行復孔，取平均值。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，隨后95 ℃延伸15 s，95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。反應結束后記錄擴增曲線和熔解曲線，以確定標本擴增的特異性。根據PCR擴增曲線，得到每個標本的循環閾值(Ct值)，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達水平。

1.5觀察指標 (1)胎鼠存活率。記錄兩組胚胎總著床數、存活數、平均窩仔數及存活率。(2)胎鼠體質量、胎盤質量及胎盤轉運效率。記錄實驗組與對照組胎鼠體質量、胎盤質量及胎盤轉運效率[胎鼠出生體質量(g)/胎盤質量(g)]。(3)目的基因mRNA表達水平。記錄實驗組與對照組胎盤的葡萄糖轉運體mRNA表達水平、胎盤的氨基酸轉運體mRNA表達水平。

2 結 果

2.1兩組胎鼠存活率比較 實驗組與對照組胚胎總著床數、存活數差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組平均窩仔數、存活率低于對照組(P<0.05)，見表2。

表1 目的基因及內參GAPDH引物序列

表2 兩組胎鼠存活率比較

2.2兩組胎鼠體質量、胎盤質量及胎盤轉運效率比較 實驗組與對照組胎盤轉運效率差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組胎鼠體質量、胎盤質量均低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組胎鼠體質量、胎盤質量及胎盤轉運效率比較

2.3兩組胎盤的葡萄糖轉運體mRNA表達水平比較 實時熒光定量PCR檢測兩組胎盤的葡萄糖轉運體mRNA表達水平，與對照組相比，實驗組Slc2a1、Slc2a2、Slc2a3、Slc2a9、Slc2a12 mRNA表達水平下調(P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4兩組氨基酸轉運體mRNA表達水平比較 與對照組相比，實驗組Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Slc43a2、Slc7a5、Slc7a8 mRNA表達水平下調(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

PCOS是一種病因較為復雜的婦科疾病，具有非遺傳理論與遺傳理論兩種[9]。非遺傳學理論認為，妊娠期子宮內激素會產生變化，引起內分泌異常，而長期暴露在高濃度雄激素環境下，增加排卵功能障礙發生率[10-11]。而遺傳學理論認為，PCOS具有一定的遺傳史、家族史，高雄激素血癥和(或)高胰島素血癥均會增加PCOS的發生[12]。國外學者在一個經過充分驗證的 PCOS 綿羊模型中發現，除了成年期代謝和生殖疾病外，早期妊娠暴露于高雄激素可以導致雌性后代的出生體質量偏低，胎盤供血不足是該模型中胎兒低出生體質量發生的機制，這種現象是由雄激素作用介導的[13-14]。在人類和動物模型中，與不良的妊娠和分娩結果有關的胎盤機制包括胎盤氧化和氧化應激、炎癥等，這些均能引起脂質積聚，加速胎盤老化，但尚少見關于營養轉運是否受損的相關機制研究[11]。

國外學者研究表明，孕期暴露在高雄激素環境下能引起小鼠雌性后代出現男性化特征，而高雄激素血癥亦可引起外生殖器男性化[15-16]。由此看出，孕期宮內暴露在高雄激素中能影響胎兒多個器官發育，增加胎兒起源的成人疾病綜合征。本研究中，實驗組平均窩仔數、存活率低于對照組(P<0.05)；實驗組胎鼠體質量、胎盤質量均低于對照組(P<0.05)，說明宮內暴露于高雄激素中會降低小鼠窩仔數、存活率，亦可降低胎鼠體質量及胎盤質量[17-18]。國外學者將接受體外受精-胚胎移植治療的460例患者作為研究對象，隨機分為PCOS組、僅多囊卵巢組(PCOM組)及卵巢形態正常的不孕組，結果表明，PCOS組的獲卵率、第二次減數分裂中期的卵母細胞率及正常形態卵母細胞率明顯減少，卵母細胞形態異常增加，細胞質量下降，導致胎兒出生體質量下降。這主要是由于高雄激素環境能引起子宮內膜功能異常，抑制機體性腺激素激動，降低雄激素水平。同時，持續的高雄激素環境能引起機體肥胖、胰島素抵抗及代謝異常，導致產科并發癥、新生兒并發癥發生風險升高。

葡萄糖是一種極性分子，很難以自由擴散方式進入細胞，細胞主要通過主動轉運方式吸收葡萄糖，且大部分組織包括胎盤的細胞均需要通過鑲嵌在細胞膜上的載體蛋白質——葡萄糖(GLUTs)介導的易化擴散來攝入葡萄糖。葡萄糖屬于胎兒生長發育的基礎營養物質[19]。胎盤絨毛組織中芳香化酶能作用于雄激素中，引起轉運體發生變化，從而對小鼠胎盤營養轉運體產生影響。轉運蛋白是膜蛋白的一大類，介導生物膜內的化學物質及信號交換。脂質雙分子層在細胞或細胞器周圍形成一道疏水屏障，將其與周圍環境隔絕起來。盡管小分子能通過滲透方式通過細胞膜，但多數的親水化合物均需要特異性的轉運蛋白幫助通過疏水屏障。因此，轉運蛋白在營養物質的攝取、代謝產物釋放和信號轉導中發揮了重要的作用。本研究中，實時熒光定量PCR檢測兩組胎盤的葡萄糖轉運體mRNA表達水平，與對照組相比，實驗組Slc2a1、Slc2a2、Slc2a3、Slc2a9、Slc2a12 mRNA表達水平下調(P<0.05)；兩組胎盤的氨基酸轉運體mRNA表達水平相比，實驗組Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Slc43a2、Slc7a5、Slc7a8 mRNA表達水平下調(P<0.05)，說明宮內暴露在高雄激素中能引起小鼠胎盤的葡萄糖轉運體mRNA表達水平下調，影響轉運蛋白表達水平。出現這種現象的原因是多方面的，可能與機體營養代謝異常有關，機體營養代謝異?？蓪е罗D運蛋白表達水平異常，從而引起胎兒低出生體質量。

綜上所述，宮內暴露于高雄激素中能降低胎鼠體質量及胎盤質量，能降低胎盤氨基酸和葡萄糖轉運體mRNA表達水平，提示高雄激素暴露可能影響妊娠期胎兒宮內的營養物質獲取，從而影響胎兒的生長發育。