孕前保健男性年齡與精子DNA碎片、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性分析*

庾偉堅(jiān)，路瑞靜，江 凡，陳 獻(xiàn)，梁淑馨，胡 蝶，周喜友

廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518102

研究顯示，生殖健康已成為世界性問題，約影響20%的育齡期家庭[1-2]，其中男性因素單獨(dú)占1/3[3]。眾所周知，男性年齡>35歲或是>40歲被認(rèn)為是高齡，并可直接影響妊娠結(jié)局。隨著年齡的增加，男性在性激素水平、氧壓力、體細(xì)胞突變、感染等方面面臨更大的選擇性壓力進(jìn)而延長(zhǎng)備孕時(shí)間，嚴(yán)重的可導(dǎo)致體外胚胎植入失敗，甚至影響新生命的健康[4-6]。目前臨床評(píng)估男性生殖能力主要依賴傳統(tǒng)的描述性的精液常規(guī)檢查參數(shù)，包括精液體積，精子數(shù)量、形態(tài)、活力、存活率等，但因無法準(zhǔn)確衡量男性生育能力的高低而制約其臨床應(yīng)用。

精子DNA碎片指數(shù)(DFI)可衡量精子核DNA結(jié)構(gòu)完整性，是影響胚胎完整發(fā)育的關(guān)鍵因素。當(dāng)精子DNA結(jié)構(gòu)受損時(shí)，可影響妊娠結(jié)局，例如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[7]；因此，DFI可成為新的評(píng)估精子質(zhì)量和預(yù)測(cè)生育結(jié)局的臨床指標(biāo)。本研究旨在探討年齡與精子DNA結(jié)構(gòu)完整性以及傳統(tǒng)精液常規(guī)各項(xiàng)參數(shù)之間的臨床關(guān)聯(lián)性，為臨床全面客觀評(píng)估男性生育力提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年5月至2019年6月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院生殖健康科進(jìn)行孕前保健檢查的男性1 237例，年齡21～58歲。排除患有腫瘤、無精子癥、精索靜脈曲張、配偶不良孕產(chǎn)史、隱睪癥等男性患者。依據(jù)年齡截點(diǎn)分為3組，分別為20～29歲、30～39歲和≥40歲。

1.2方法

1.2.1精液標(biāo)本獲取 就診男性禁欲2～7 d，采用手淫法獲取精液標(biāo)本置于無菌取精杯中迅速運(yùn)送至精液分析實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2精液常規(guī)參數(shù)分析 將精液標(biāo)本置于37 ℃恒溫水浴箱中振蕩液化30 min，液化完全后進(jìn)行精液常規(guī)檢驗(yàn)。采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析獲取精液常規(guī)各項(xiàng)參數(shù)。

1.2.3精子形態(tài)參數(shù)分析 吸取20 μL混勻的精液標(biāo)本制作2張精子涂片，采用Diff-Quik (BioMart,深圳,中國(guó))快速染液進(jìn)行染色。200倍鏡下觀察精子形態(tài)，并連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算精子正常形態(tài)百分率、精子頭部畸形數(shù)。

1.2.4精子DFI分析 利用SCSA方法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)精子DFI和精子成熟度。檢測(cè)試劑盒為精子核完整性染色試劑盒(珠海安達(dá)圣物科技有限公司，珠海，中國(guó))。流式細(xì)胞術(shù)至少計(jì)數(shù)5 000條精子為有效數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行整理分析，呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(M)和四分位數(shù)(P25～P75)表示，3組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行組間兩兩分析；相關(guān)分析采用Spearman分析，采用多因素Logistic回歸分析各精液參數(shù)間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1精液常規(guī)參數(shù)一般情況 如表1所示，≥40歲男性的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率與20～29歲男性相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);≥40歲男性的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、精液體積、不動(dòng)精子百分率與30～39歲男性相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中隨著孕前保健男性年齡的增加，前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率顯著降低(P<0.05)。正常形態(tài)精子百分率、精子濃度、精子總數(shù)、精子成熟度、禁欲天數(shù)、精液pH、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及頭部畸形精子百分率等精液臨床參數(shù)在3組年齡男性中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2年齡與精子DFI的相關(guān)關(guān)系 如圖1所示，相比20～29歲、30～39歲孕前保健男性群體，≥40歲男性精子DFI顯著增加(P<0.001，圖1A)；而20～29歲與30～39歲男性群體精子DFI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖1A)。年齡與精子DFI存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.11，P<0.000 1，圖1B)，表現(xiàn)在≥40歲男性相關(guān)關(guān)系更顯著(r=0.18,P<0.000 1，圖1E)，20～29歲和30～39歲男性群體年齡與精子DFI無相關(guān)關(guān)系(P>0.05，圖1C、1D)。

表1 基于年齡分組的精液臨床參數(shù)一般信息[M(P25～P75)]

注：A為精子DFI在20～29歲、30～39歲、≥40歲孕前保健男性群體之間的分布，兩組間比較，*P<0.001，**P<0.000 1；B為孕前保健男性群體精子DFI與其對(duì)應(yīng)孕前保健男性年齡之間的關(guān)聯(lián)性；C為20～29歲孕前保健男性群體中年齡與其對(duì)應(yīng)精子DFI的關(guān)聯(lián)性；D為30～39歲孕前保健男性群體精子DFI與其年齡的關(guān)聯(lián)性；E為≥40歲孕前保健男性群體精子DFI與其年齡的關(guān)聯(lián)性。

2.3精子DFI與其他精液臨床參數(shù)之間的相關(guān)性分析 精子DFI與正常精子形態(tài)百分率、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.21、-0.11、-0.45、-0.45、-0.21，均P<0.05)；而與禁欲天數(shù)、精液體積、不動(dòng)精子百分率、頭部畸形精子百分率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.14、0.13、0.46、0.21，均P<0.05)。與20～29歲男性群體相比，30～39歲及≥40歲男性在前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、不動(dòng)精子百分率和頭部畸形精子百分率這5個(gè)精液參數(shù)中呈更強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。見表2。

表2 DFI與精液常規(guī)基于年齡分組相關(guān)性分析

續(xù)表2 DFI與精液常規(guī)基于年齡分組相關(guān)性分析

2.4多因素Logistic回歸分析精子DNA碎片的風(fēng)險(xiǎn)因素 如表3所示，應(yīng)用多變量Logistic回歸分析顯示, 年齡、精液體積和不動(dòng)精子百分率是精子DNA碎片的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=1.031、1.215、1.038)。正常形態(tài)精子百分率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子成熟度和非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率是精子DNA碎片的保護(hù)性因素(OR=0.912、0.011、0.966、0.968)。

表3 精子DNA碎片與年齡及精液臨床參數(shù)的多變量Logistics回歸分析

3 討 論

研究證實(shí)，年齡增加與精液質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；年齡可影響性激素水平，增大機(jī)體氧化應(yīng)激壓力，增加體細(xì)胞突變率，從而進(jìn)一步影響男性生殖能力[8]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)男方高齡對(duì)處于分裂期的受精卵和胚胎質(zhì)量并無顯著影響[9]。另一項(xiàng)在415對(duì)夫妻試管嬰兒的研究中發(fā)現(xiàn)妊娠結(jié)局與男方高齡沒有顯著關(guān)聯(lián)[10]。因而，目前有關(guān)年齡影響男性生育能力的具體的細(xì)節(jié)性研究仍存在較大爭(zhēng)議，亟待更準(zhǔn)確地研究評(píng)估年齡和男性生育能力之間的關(guān)系。

本研究主要闡述年齡對(duì)精液常規(guī)參數(shù)以及精子DNA結(jié)構(gòu)完整性的影響。研究結(jié)果顯示，年齡的增加可顯著影響精子正常形態(tài)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、精液體積、不動(dòng)精子百分率以及頭部畸形精子百分率等傳統(tǒng)的描述性的精液常規(guī)參數(shù)。另外，隨著年齡的增加，精子DFI也呈顯著增加的態(tài)勢(shì)，且年齡與精子DFI呈正相關(guān)關(guān)系。這種正相關(guān)關(guān)系更加明顯地表現(xiàn)在≥40歲男性群體；年齡在40歲以下的男性群體，精子DFI變化與年齡并無顯著相關(guān)性。類似的研究結(jié)果在一項(xiàng)1 124例≥40歲的男性群體研究中也得到證實(shí)[8]。精子DFI是評(píng)估胚胎質(zhì)量的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于生殖實(shí)驗(yàn)室，可直接反映精子DNA結(jié)構(gòu)完整性程度，并與男性生殖能力緊密相關(guān)。研究表明不育男性的DFI顯著高于正常男性[11-12]，因此，本研究進(jìn)一步分析了精子DFI與傳統(tǒng)精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子DFI與部分描述性精液常規(guī)參數(shù)存在正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)關(guān)系。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)與20～29歲男性群體相比，30～39歲及≥40歲男性在前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子存活率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、不動(dòng)精子百分率和頭部畸形精子百分率這5個(gè)精液參數(shù)中呈更強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。為了消除一些混雜因素的影響，利用Logistic回歸分析精子DNA碎片的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果證實(shí)年齡是精子DNA碎片的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果更進(jìn)一步證實(shí)了年齡可一定程度上影響傳統(tǒng)的精液常規(guī)參數(shù)和精子DNA結(jié)構(gòu)完整性，可為臨床生殖實(shí)驗(yàn)室評(píng)估男性精液質(zhì)量，特別是高齡男性生育能力提供可靠的證據(jù)。

迄今為止，有關(guān)年齡如何影響精液參數(shù)質(zhì)與量的研究結(jié)論尚未完全明朗，存在多方面影響因素。一些研究顯示，由于年齡增加而致使體內(nèi)活性氧(ROS)的增加、降低精子抗氧化保護(hù)屏障以及機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的精子損傷等原因可降低精液質(zhì)量合格程度[13-14]；類似的研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)過量的ROS水平與精子DNA結(jié)構(gòu)損害程度呈正相關(guān)關(guān)系。另外，有研究證實(shí)男性高齡可能會(huì)影響精子DNA結(jié)構(gòu)受損時(shí)的結(jié)構(gòu)重塑過程，從而致使精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域組裝失敗并且嚴(yán)重降低其DNA片段修復(fù)能力[15-16]。這些研究可在一定程度上解釋了高齡男性對(duì)氧化應(yīng)激攻擊的脆弱性，從而導(dǎo)致其生育能力低下。因此，后續(xù)需要更多的研究聚焦探索年齡影響精子DNA結(jié)構(gòu)改變的其他機(jī)制，如生殖細(xì)胞突變等方面機(jī)制。由于回顧性分析的限制，本研究未能收集到其他地區(qū)以及不同生活環(huán)境的受試者信息以減少偏倚性，因而后續(xù)也需要不同地域的多中心的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究印證結(jié)果的準(zhǔn)確性。