應用回歸方程設置CLIA法檢測梅毒抗體的灰區范圍

張志遠，羅夏菲，劉榮靜△

廣州醫科大學附屬第二醫院：1.檢驗科；2.產科，廣東廣州 510260

梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性全身性傳播疾病，在我國屬于法定乙類傳染病，血清學試驗是臨床實驗室檢測梅毒的常用方法。化學發光免疫分析(CLIA)法憑借其靈敏度高、特異性強、結果判定客觀、適于自動化檢測等諸多優點，被臨床廣泛應用于梅毒抗體的檢測[1-2]。但是作為一種篩查方法，其檢測結果中有一定比例的假陽性，臨床實驗室將這些假陽性結果報告出去，可能會讓臨床醫生產生疑惑，或者給受檢者帶來一些麻煩和心理傷害，甚至會引起醫患糾紛。為了減少因試驗假陽性造成的誤診，提高檢驗報告準確性，可以將測定中處于臨界值(Cut-off值)附近、臨床意義可疑的一部分結果，設置為檢測的“灰區范圍”，達到提醒臨床醫生注意和重視的目的。筆者對本實驗室使用CLIA法檢出的878例梅毒抗體陽性血清標本，采用梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)為確證試驗進行確認，通過研究CLIA法S/CO值與檢測陽性預測值的相關關系，獲得兩者間的關系模型及回歸方程，并以此設置本實驗室CLIA法檢測梅毒抗體的灰區范圍，現將方法和結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1-12月廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科使用CLIA法檢測梅毒抗體結果為陽性(S/CO≥1)的血清標本，共計878例。

1.2儀器與試劑 Architect i2000全自動化學發光免疫分析儀及原裝配套試劑，來自美國雅培公司；TPPA試劑盒(內含溶解液、血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子、陽性對照血清)，為日本富士瑞必歐株式會社產品；質控品來自廣東省臨床檢驗中心。

1.3方法

1.3.1標本處理 干燥管抽取靜脈血液3～5 mL，待血液自行凝固后3 500 r/min離心5 min，分離血清待檢。

1.3.2CLIA的檢測流程及結果判定 (1)對Architect i2000全自動化學發光免疫分析儀進行常規維護和保養；(2)項目質控監測，質控合格后開始標本的檢測；(3)記錄每個標本測得的S/CO值。結果判定：S/CO值≥1判定為梅毒抗體陽性，S/CO值<1判定為梅毒抗體陰性。

1.3.3TPPA的檢測流程及結果判定 (1)用微量加樣器將血清稀釋液加入微量反應板中，第1孔100 μL，第2孔至第4孔各25 μL；(2)吸取25 μL標本至第1孔中，吹打混合均勻，然后吸出25 μL加入第2孔，以2n的方式稀釋至第4孔；(3)向第3孔中滴入25 μL未致敏粒子，在第4孔中滴入25 μL致敏粒子；(4)用振蕩混勻器以不會導致微量反應板內容物濺出的強度振蕩混勻30 s，加蓋后于室溫(15～30 ℃)水平靜置。2 h后，觀察其反應圖像并進行結果判斷和記錄。結果判定：觀察微量反應板第3、4孔中粒子形成的反應圖像，參照表1進行判斷。

表1 TPPA反應圖像判定表

1.4統計學處理 對878例血清標本經CLIA法檢測獲得的S/CO值，按照S/CO≥值1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11將標本分為6組，以TPPA結果為金標準，計算出各組CLIA法檢測的陽性預測值；對各組的陽性預測值與S/CO值的關系進行曲線擬合，分析最適合的曲線模型并建立回歸方程。

1.5檢驗體系灰區的設置 為了使灰區范圍以外的陽性結果有95%以上的可信度，根據曲線擬合建立的回歸方程，計算出CLIA法檢測陽性預測值達到95%時的S/CO值，設為本實驗室CLIA法檢測血清梅毒抗體灰區范圍的上限，以S/CO值=1設置為灰區的下限。

2 結 果

2.1TPPA法對878例CLIA法檢測梅毒抗體呈陽性的血清標本確認結果 878例標本經TPPA法檢測，確認陽性(包含弱陽性)標本779例，陰性標本99例。CLIA法的陽性預測值為88.72%。如表2所示，S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6個組的陽性預測值分別為50.77%、79.28%、89.28%、97.80%、98.57%、100.00%。

表2 S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6組標本TPPA確認結果

2.2CLIA法檢測血清梅毒抗體S/CO值與檢測陽性預測值的相關性分析 使用SPSS20.0軟件對表2的數據進行曲線估計，表3是11種曲線模型的擬合結果，其中S型模型有統計學意義(P=0.000)，決定系數R2=0.997最高，故為最適合的模型。建立的S型模型的回歸方程：Y=e-1.692/X+0.174，其中自變量X為S/CO值，因變量Y為陽性預測值。圖1為S型模型的擬合曲線，可見效果比較滿意。

表3 表2數據11種模型曲線擬合結果

圖1 表2數據S型模型的擬合曲線

2.3灰區范圍設置 根據S型曲線回歸方程Y=e-1.692/X+0.174，當陽性預測值Y=0.95時，X=7.52。即S/CO=7.52時，陽性預測值可達95%。因此可設置檢驗體系的灰區為1≤S/CO值≤7.52。

3 討 論

抗體檢測的假陽性問題是長期以來梅毒研究者廣泛關注的熱點之一[3]。近年來，盡管全自動化學發光儀和檢測試劑的性能都取得了很大提升，但CLIA法檢測梅毒抗體假陽性問題依然沒有得到令臨床滿意的解決方案。因此，世界各國和地區都采用了多元化的梅毒血清學診斷策略。美國疾病預防與控制中心、加拿大梅毒實驗室工作小組和中國國家衛生健康委員會出臺的相關指南和行業標準，都推薦了使用TPPA對CLIA法檢測呈陽性的標本進行復查。多項研究也證明TPPA有較高的靈敏度和特異度，可作為梅毒抗體檢測的確證試驗。

在本研究中，878份CLIA法檢測為陽性的標本，經TPPA檢測后確認有99例實際應為陰性，即有11.28%的標本經CLIA法檢測結果呈假陽性。分析其原因：(1)CLIA法檢測梅毒抗體的結果判定標準是將標本中存在的梅毒抗體經過一系列反應后產生的化學發光信號與預先校準確定的Cut-off信號進行比較，根據S/CO值是否≥1確定標本是否存在梅毒抗體。為了保證檢測體系有較高的靈敏度，儀器在設定Cut-off信號時會將其設定得偏低，相應地會使得檢測結果S/CO值偏高，導致部分結果為假陽性。(2)標本來源。相關研究表明，惡性腫瘤、心血管疾病、肝炎、自身免疫性疾病、血液病等疾病患者的血清中可能含有某些治療性抗體、類脂嗜異性抗體、自身抗糖尿病抗體、類風濕因子、甲胎蛋白等[4-5]，這些物質能夠與試劑中的抗原成分非特異性結合，從而產生假陽性。另外，年齡也是假陽性產生的一個重要因素，一些研究表明老年人梅毒抗體測定的假陽性率偏高[6-7]，且陽性率隨年齡增大呈階梯性增高[8-10]，可能是因為老年人身體功能衰退，能夠產生一些干擾化學發光反應的異常蛋白質[11]。在本研究中，99例假陽性標本中，來源是60歲以上的患者占45.5%。

對CLIA法檢測梅毒抗體的檢測體系進行灰區的設置，可以提高檢測報告的準確性和嚴謹性，并能夠有針對性地對標本進行復查，提高檢測效率，節省成本。灰區的設置方法有多種，例如舒豐等[12]應用ROC曲線對AutoLumo A2000化學發光儀檢測梅毒抗體進行了灰區設置；許曉峰等[13]認為，使用CLIA法檢測梅毒抗體時，對于陽性預測值大于95%的檢測結果，可以不必進行確診試驗以減少工作量。然而根據表2發現，CLIA法檢測梅毒抗體的陽性預測值隨S/CO值增大而升高，S/CO值與陽性預測值之間存在某種相關關系。因此本研究采用曲線擬合的方法，確認了S/CO值與陽性預測值的數量關系呈S型，并獲得了兩者的回歸方程。通過回歸方程，不僅可以計算出陽性預測值達到95%時的S/CO值，將其作為CLIA法灰區的上限，并且可以根據任何一個陽性標本的S/CO值，計算它為真陽性的概率，從某種程度上講這比設置檢驗方法的灰區更有意義。國內有研究顯示，CLIA法檢測梅毒抗體的靈敏度和陰性預測值均為100%[14]，表明使用CLIA法檢測梅毒抗體幾乎可以排除假陰性情況的出現。因此，本研究可以將S/CO值=1作為灰區的下限，并將灰區范圍最終設置為1≤S/CO值≤7.52。據統計，2019年本實驗室梅毒抗體檢測處于灰區范圍外的陽性標本約為530例，若與臨床醫生加強溝通，注重流行病學調查，則可為這些患者節省復查費用，節約醫療資源。對于處于灰區范圍內，尤其是非孕產婦、老年人、腫瘤及血液病患者等，應該進行TPPA等確證試驗進行復查確認，以提高診斷準確率。

需要說明的是，入選本研究的S/CO值≥11的標本，陽性預測值達到了100%，并不代表不會出現假陽性的情況。但是這并不影響S/CO值與陽性預測值關系方程的建立，因為S/CO值≥11的分組其陽性預測值非常接近100%，將其應用于曲線估計模型時的意義并不大，也不會影響回歸方程的系數。本研究在進行曲線擬合時使用了表2的前5組數據，并以每組S/CO值范圍的中位數作為該組的檢測陽性預測值，這可能會使曲線模型的估計及回歸方程的系數產生一定偏差。