6-BA與NAA不同配比在毛建草組織培養中的作用研究

李文超 張明艷 葉鵬 張育溎 靳亞鑫 田鵬宇 宋敏麗

摘? ? 要：為了研究6-BA和NAA不同濃度配比對毛建草組織培養的影響，以葉片和葉柄為外植體，分別接種到同時含有0.5 mg/L 6-BA和不同濃度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養基上，統計愈傷組織的個數并計算誘導率。結果發現，相同條件下，葉柄作為外植體時，愈傷組織的生長狀況明顯優于葉片;當0.5 mg/L 6-BA配比0.2 mg/L NAA時，葉柄長出愈傷組織的個數最多，誘導率達到100%，顯著超過了其他組合。

關鍵詞：毛建草;外植體;6-BA;NAA

文章編號：1005-2690（2021）22-0025-02? ? ? ?中國圖書分類號：S531? ? ? ?文獻標志碼：B

毛建草又稱毛尖、巖青蘭，據《中藥大辭典》記載，巖青蘭可全草代茶，主治外感風熱、頭痛寒熱、咳嗽、黃疸性肝炎[1-2]。近年來，采用不同的方法對毛建草的化學成分進行分析和鑒定[3-5]，已經發現毛建草具有多種藥用價值，如抗癌、抗氧化[6]、保護心肌[7]等。

由于毛建草具有很高的經濟價值和藥用價值，利用植物組織培養技術加速培育毛建草尤為迫切。目前，張彥廣利用萌蘗根部對毛建草進行了初步引種栽培[8]，劉俊等首次建立了毛建草的離體培養快繁體系[9]，宗越等對不同外植體誘導愈傷組織的效果進行了比較[10]，進一步確定了激素配比在誘導毛建草愈傷組織中的關鍵作用。本研究以毛建草的葉片和葉柄為外植體，嘗試在缺乏莖段的條件下用材料充足的葉片和葉柄快速誘導愈傷組織，為毛建草的人工培育奠定基礎。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗材料

1.1.1? ?植物材料

在人工氣候培養箱中生長4周的毛建草，取其幼嫩的葉片和葉柄作為外植體。

1.1.2? ?主要試劑

無菌水、無水乙醇、細胞分裂素6-BA、萘乙酸NAA、NaOH、蔗糖、瓊脂。

1.1.3? ?主要儀器

電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、BIC-300人工氣候培養箱、JB-CJ-1000FX潔凈工作臺。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?MS培養基配制

（1）根據培養基配方及需要配制的體積，計算各種藥品和母液的用量，按照大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、生長調節物質、母液的順序編號置于操作臺上，按順序量取各種母液于燒杯中。

（2）稱取瓊脂、蔗糖等固體物質放入燒杯中，量取去離子水于不銹鋼容器中（體積約為培養基的80%），用電磁爐加熱將水燒開。

（3）水開后，加入母液、瓊脂、蔗糖等攪拌，防止粘鍋，直至瓊脂全部溶解。

（4）用1 mol/L的NaOH調節pH值到5.8，趁熱分裝，每瓶約40 mL。用棉塞封口后包扎好放入高壓滅菌鍋，滅菌20 min，待培養基自然冷卻和凝固后備用。

1.2.2? ?外植體滅菌

挑選10片幼嫩、干凈的毛建草葉片，連葉柄一起摘下，在流水中用軟毛刷蘸上洗衣粉刷洗外植體并沖洗干凈。在超凈臺中用無菌鑷子將外植體放入無菌空瓶，加入70%酒精，輕輕搖晃30 s，然后用無菌水沖洗干凈。將外植體轉移到另一個無菌空瓶，加入濃度為30%的84消毒液，滴幾滴吐溫-80，輕輕搖勻后浸泡10 min;用無菌水沖洗3～4次，備用。

1.2.3? ?外植體接種

（1）將所需要的工具、無菌水和培養基放入超凈工作臺中進行紫外照射，30 min后關閉紫外燈并鼓風5 min。

（2）用酒精棉球擦拭雙手、臺面和接種工具，準備接種。

（3）將培養基瓶口在酒精燈附近打開并盡量在超凈工作臺靠近里面操作，鑷子和解剖刀在酒精燈上從頭到尾過火，尖端燒紅，置于無菌的培養皿上冷卻（接種刀具每用一次需重新滅菌）。

（4）將滅菌的葉片和葉柄用鑷子夾出來，放到無菌的培養皿上，用解剖刀將葉片和葉柄分離，葉片切成邊長為5 mm的正方形，葉柄切成5 mm左右的小段，接種到含有0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養基上，每個瓶子接種3個葉片或葉柄，重復3次。接種完畢后，用封口膜封好并貼上標簽，放入人工氣候培養箱25 ℃光照培養，觀察并記錄數據。

2? ?結果與分析

將葉片、葉柄分別接入含有0.5 mg/L 6-BA配比不同濃度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養基上后，第7天觀察發現，葉片沒有明顯變化，但是葉柄大部分有愈傷組織長出;第9天，葉柄全部長出愈傷組織，而葉片偶爾有愈傷組織長出。15 d后愈傷組織的生長情況見表1、表2。0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA對葉片愈傷組織的誘導效果極低，誘導率僅有11.1%。相比之下，這種激素配比對葉柄愈傷組織的誘導非常有效，3種處理愈傷組織的個數均顯著高于葉片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA條件下，葉柄長出愈傷組織的個數最多，誘導率達到100%，明顯高于其余兩種處理，因此，葉柄作為外植體誘導愈傷組織的最適激素配比為0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3? ?結論與討論

植物組織培養又稱為植物克隆，是指通過無菌操作將植物體的各種結構材料即外植體，包括根尖、莖段、莖尖、幼葉、幼胚、花藥等接種于人工配制的培養基上，在人工控制環境條件下進行離體培養的技術與方法。植物組織培養不僅速度快，而且可以擺脫自然地理環境和季節的限制，對繁殖系數低和經濟價值高的植物品種具有重要意義。

在植物組織培養中，6-BA是一種常用、首選的細胞分裂素，具有促進外植體細胞分裂進而誘導不定芽產生的作用。6-BA可單獨使用，也可與一定濃度的其他激素如NAA、IAA等聯合使用。6-BA、NAA和（或）IAA的濃度配比因植物種類和外植體不同而不同。劉俊等建立的毛建草離體快繁體系中，采用0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA作為芽誘導培養基的激素配比。宗越用0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作為誘導愈傷組織的最佳激素配比。

在本試驗中，發現0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA對毛建草葉片愈傷組織的誘導幾乎沒有效果，誘導率極低，原因一方面可能是6-BA+NAA的濃度配比不利于葉片愈傷組織的誘導，另一方面可能是葉片較其他部位不易長出愈傷組織。相比之下，葉柄長出愈傷組織的個數明顯超過葉片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA對葉柄愈傷組織的誘導率達到100%，因此，在莖段較少的情況下，可以用葉柄來代替莖段產生愈傷組織。由于材料數量的限制，參考宗越等以毛建草莖段為外植體時6-BA的最適濃度為0.5 mg/L，但是，因為外植體不同，誘導葉柄和莖段產生愈傷組織所需6-BA的最適濃度可能并不相同，有待進一步驗證。

參考文獻：

[1]中科院中國植物志編委會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1997：378.

[2]丁聰，李遠輝，康恒軍.巖青蘭的化學成分及藥理學研究綜述[J].藥學研究，2013，32（11）：663-664.

[3]任冬梅，袁久榮.巖青蘭化學成分的研究[J].中草藥，1997（2）：74-76.

[4]任冬梅，婁紅祥，季梅.巖青蘭化學成分的研究（Ⅱ）[J].中國藥學雜志，2005（22）：25-26.

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[6]郝娜，馬偉偉，黃航君，等.巖青蘭化學成分及抗氧化活性[J].河北大學學報（自然科學版），2018，38（6）：617-622.

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[8]張彥廣.河北省野生花卉調查及部分種的引種栽培研究[D].北京：北京林業大學，2006.

[9]劉俊，孫瑞芬，耿牡丹，等.毛建草離體培養快繁體系的建立[J].北方農業學報，2017，45（6）：102-106.

[10]宗越，郭曉紅，田旭平.毛建草莖段愈傷組織的誘導及繼代培養試驗[J].山西農業科學，2019，47（4）：507-509.