6-BA與NAA不同配比在毛建草組織培養(yǎng)中的作用研究

李文超 張明艷 葉鵬 張育溎 靳亞鑫 田鵬宇 宋敏麗

摘? ? 要：為了研究6-BA和NAA不同濃度配比對(duì)毛建草組織培養(yǎng)的影響，以葉片和葉柄為外植體，分別接種到同時(shí)含有0.5 mg/L 6-BA和不同濃度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的個(gè)數(shù)并計(jì)算誘導(dǎo)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同條件下，葉柄作為外植體時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于葉片;當(dāng)0.5 mg/L 6-BA配比0.2 mg/L NAA時(shí)，葉柄長(zhǎng)出愈傷組織的個(gè)數(shù)最多，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，顯著超過了其他組合。

關(guān)鍵詞：毛建草;外植體;6-BA;NAA

文章編號(hào)：1005-2690（2021）22-0025-02? ? ? ?中國圖書分類號(hào)：S531? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

毛建草又稱毛尖、巖青蘭，據(jù)《中藥大辭典》記載，巖青蘭可全草代茶，主治外感風(fēng)熱、頭痛寒熱、咳嗽、黃疸性肝炎[1-2]。近年來，采用不同的方法對(duì)毛建草的化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定[3-5]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)毛建草具有多種藥用價(jià)值，如抗癌、抗氧化[6]、保護(hù)心肌[7]等。

由于毛建草具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)加速培育毛建草尤為迫切。目前，張彥廣利用萌蘗根部對(duì)毛建草進(jìn)行了初步引種栽培[8]，劉俊等首次建立了毛建草的離體培養(yǎng)快繁體系[9]，宗越等對(duì)不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效果進(jìn)行了比較[10]，進(jìn)一步確定了激素配比在誘導(dǎo)毛建草愈傷組織中的關(guān)鍵作用。本研究以毛建草的葉片和葉柄為外植體，嘗試在缺乏莖段的條件下用材料充足的葉片和葉柄快速誘導(dǎo)愈傷組織，為毛建草的人工培育奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

1.1.1? ?植物材料

在人工氣候培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)4周的毛建草，取其幼嫩的葉片和葉柄作為外植體。

1.1.2? ?主要試劑

無菌水、無水乙醇、細(xì)胞分裂素6-BA、萘乙酸NAA、NaOH、蔗糖、瓊脂。

1.1.3? ?主要儀器

電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、BIC-300人工氣候培養(yǎng)箱、JB-CJ-1000FX潔凈工作臺(tái)。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?MS培養(yǎng)基配制

（1）根據(jù)培養(yǎng)基配方及需要配制的體積，計(jì)算各種藥品和母液的用量，按照大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、母液的順序編號(hào)置于操作臺(tái)上，按順序量取各種母液于燒杯中。

（2）稱取瓊脂、蔗糖等固體物質(zhì)放入燒杯中，量取去離子水于不銹鋼容器中（體積約為培養(yǎng)基的80%），用電磁爐加熱將水燒開。

（3）水開后，加入母液、瓊脂、蔗糖等攪拌，防止粘鍋，直至瓊脂全部溶解。

（4）用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值到5.8，趁熱分裝，每瓶約40 mL。用棉塞封口后包扎好放入高壓滅菌鍋，滅菌20 min，待培養(yǎng)基自然冷卻和凝固后備用。

1.2.2? ?外植體滅菌

挑選10片幼嫩、干凈的毛建草葉片，連葉柄一起摘下，在流水中用軟毛刷蘸上洗衣粉刷洗外植體并沖洗干凈。在超凈臺(tái)中用無菌鑷子將外植體放入無菌空瓶，加入70%酒精，輕輕搖晃30 s，然后用無菌水沖洗干凈。將外植體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無菌空瓶，加入濃度為30%的84消毒液，滴幾滴吐溫-80，輕輕搖勻后浸泡10 min;用無菌水沖洗3～4次，備用。

1.2.3? ?外植體接種

（1）將所需要的工具、無菌水和培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)中進(jìn)行紫外照射，30 min后關(guān)閉紫外燈并鼓風(fēng)5 min。

（2）用酒精棉球擦拭雙手、臺(tái)面和接種工具，準(zhǔn)備接種。

（3）將培養(yǎng)基瓶口在酒精燈附近打開并盡量在超凈工作臺(tái)靠近里面操作，鑷子和解剖刀在酒精燈上從頭到尾過火，尖端燒紅，置于無菌的培養(yǎng)皿上冷卻（接種刀具每用一次需重新滅菌）。

（4）將滅菌的葉片和葉柄用鑷子夾出來，放到無菌的培養(yǎng)皿上，用解剖刀將葉片和葉柄分離，葉片切成邊長(zhǎng)為5 mm的正方形，葉柄切成5 mm左右的小段，接種到含有0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)瓶子接種3個(gè)葉片或葉柄，重復(fù)3次。接種完畢后，用封口膜封好并貼上標(biāo)簽，放入人工氣候培養(yǎng)箱25 ℃光照培養(yǎng)，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2? ?結(jié)果與分析

將葉片、葉柄分別接入含有0.5 mg/L 6-BA配比不同濃度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培養(yǎng)基上后，第7天觀察發(fā)現(xiàn)，葉片沒有明顯變化，但是葉柄大部分有愈傷組織長(zhǎng)出;第9天，葉柄全部長(zhǎng)出愈傷組織，而葉片偶爾有愈傷組織長(zhǎng)出。15 d后愈傷組織的生長(zhǎng)情況見表1、表2。0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果極低，誘導(dǎo)率僅有11.1%。相比之下，這種激素配比對(duì)葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)非常有效，3種處理愈傷組織的個(gè)數(shù)均顯著高于葉片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA條件下，葉柄長(zhǎng)出愈傷組織的個(gè)數(shù)最多，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，明顯高于其余兩種處理，因此，葉柄作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最適激素配比為0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3? ?結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)又稱為植物克隆，是指通過無菌操作將植物體的各種結(jié)構(gòu)材料即外植體，包括根尖、莖段、莖尖、幼葉、幼胚、花藥等接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制環(huán)境條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)與方法。植物組織培養(yǎng)不僅速度快，而且可以擺脫自然地理環(huán)境和季節(jié)的限制，對(duì)繁殖系數(shù)低和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的植物品種具有重要意義。

在植物組織培養(yǎng)中，6-BA是一種常用、首選的細(xì)胞分裂素，具有促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂進(jìn)而誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的作用。6-BA可單獨(dú)使用，也可與一定濃度的其他激素如NAA、IAA等聯(lián)合使用。6-BA、NAA和（或）IAA的濃度配比因植物種類和外植體不同而不同。劉俊等建立的毛建草離體快繁體系中，采用0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA作為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比。宗越用0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素配比。

在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA對(duì)毛建草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)幾乎沒有效果，誘導(dǎo)率極低，原因一方面可能是6-BA+NAA的濃度配比不利于葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，另一方面可能是葉片較其他部位不易長(zhǎng)出愈傷組織。相比之下，葉柄長(zhǎng)出愈傷組織的個(gè)數(shù)明顯超過葉片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA對(duì)葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到100%，因此，在莖段較少的情況下，可以用葉柄來代替莖段產(chǎn)生愈傷組織。由于材料數(shù)量的限制，參考宗越等以毛建草莖段為外植體時(shí)6-BA的最適濃度為0.5 mg/L，但是，因?yàn)橥庵搀w不同，誘導(dǎo)葉柄和莖段產(chǎn)生愈傷組織所需6-BA的最適濃度可能并不相同，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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