炎癥因子對肥胖大鼠肝臟組織胰島素信號通路的影響研究

范向寧　劉 柯　朱久育　王 磊　趙清娟　劉 剛　黃艷麗

[關鍵詞]炎癥;肥胖;肝臟;胰島素;胰島素抵抗;大鼠

[中圖分類號]R365.4? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）12-0102-03

Effects of Inflammatory Factors on Insulin Signal Pathway in Liver Tissue

of Obese Rats

FAN Xiang-ning，LIU Ke，ZHU Jiu-yu，WANG Lei，ZHAO Qing-juan，LIU Gang，HUANG Yan-li

（Department of Stomatology，the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，Henan，China）

Abstract： Objective? The aim of this study was to study the effect of obesity on IR associated with signal pathways in liver. Methods? Ten male SD rats were randomly divided in 2 groups： control group （Con） （fed with standard diet）; high-fat diet group （HFD） （fed with high fat diet）. The animal model was characterized in terms of body weight （BW） and Lee index. The mRNA levels of tumor necrosis factors ɑ （TNF-ɑ）， interleukin-1beta （IL-1β）， Toll-like receptor 2 （TLR2） and Toll-like receptor 4 （TLR4）， insulin receptor， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， protein kinase B （AKT） and glucose transporter type 4 （GLUT4） were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results? Compared with the control group， the TNF-α gene level in the liver tissue of the experimental group was significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. At the same time， the mRNA levels of IL-1β and TLR4 were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the control group， the expression of IR， PI3K， AKT and GLUT4 genes in the liver tissue of the experimental group was significantly reduced （P<0.05）. Conclusions? In obese rats， the insulin signal pathway was inhibited in liver tissue， which is associated with the onset or development of IR.

Key words： inflammation; obesity; liver; insulin; insulin resistance; rat

近年來，肥胖及肥胖相關的內分泌失調性疾病已經成為全球性問題[1]。肥胖可以導致免疫細胞浸入脂肪組織并分泌促炎因子，如腫瘤壞死因子-ɑ（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素（Interleukin，IL）[2]等，促進慢性炎癥的發生發展。研究表明，TNF-ɑ可以損害胰島素信號通路，在脂肪細胞和外周組織中誘導胰島素抵抗，從而導致2型糖尿病的發生[3]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是檢測微生物成分和激活免疫反應的模式識別受體。Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）和Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）位于細胞膜表面，在免疫炎癥和代謝性疾病的相互作用中發揮重要作用[4]。TLRs在炎癥和胰島素抵抗的發展中發揮重要作用[5]。本研究是探究炎癥因子對肥胖大鼠肝臟組織的胰島素信號通路的影響研究。

1? 資料和方法

1.1 實驗動物來源：PF級SD大鼠，雄性，8周齡，購自河南省動物實驗中心（SCXK2007-0001），常規飼養于新鄉醫學院動物房，自由飲水和進食，飼養溫度為20℃～24℃，晝夜節律同自然。

1.2 實驗分組：適應性喂養1周后，將實驗動物隨機分為兩組，對照組喂養標準飼料，實驗組喂養高脂飼料，一共喂養9周，然后進行各相關指標檢測。需要注意的是，每周都需要對大鼠進行體重（Body weight，BW）、體長（naso-anal length，NAL）測量。利用公式計算出Lee指數[6]。

1.3 ELISA檢測：所有大鼠禁食過夜，4%水合氯醛腹腔注射使動物全麻，通過心臟穿刺的方法收集血樣，使用鼠胰島素試劑盒量化空腹胰島素水平。血糖測量儀檢測葡萄糖水平。用HOMA指數評價大鼠的胰島素敏感性。公式如下：[HOMA-IR]=空腹血清葡萄糖（mg/dl×空腹血清胰島素（μU/ml）/22.5。

1.4 相關基因的RT-PCR檢測：Trizol提取組織總mRNA，參照First Strand cDNA Synthesis kit合成試劑盒說明書反轉錄合成cDNA模板（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。RT-PCR所用引物由上海生物工程有限公司設計合成，引物序列見表1。反應條件：95℃5s，60℃30s，40個循環;溶解曲線為95℃15s，60℃1min，95℃15s。

1.5 統計學分析：所有樣本的數量在3～5個，數值為（xˉ±s），使用Graph Pad Primer 7.0軟件來進行統計分析，數據分析使用t檢驗。當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 各組大鼠的體重及Lee指數：飼料喂養9周后，與對照組大鼠相比，實驗組大鼠的體重及Lee指數明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2 空腹血糖、空腹胰島素水平及HOMA-IR：禁食過夜后，血清檢測結果顯示：實驗組大鼠的空腹血糖水平與對照組大鼠比較，差異無統計學意義（P>0.05）;空腹胰島素水平和HOMA-IR在實驗組大鼠中的表達較對照組大鼠的表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3 肝臟組織中炎癥因子的表達：為了檢測大鼠肝組織的炎癥反應，本實驗檢測了TNF-ɑ、IL-1β、TLR2、TLR4的mRNA水平的表達。與對照組相比，實驗組大鼠肝臟組織中TNF-ɑ的mRNA水平顯著升高（P=0.0047），差異有統計學意義（P<0.05）。同時，與對照組相比，IL-1β（P=0.0013）和TLR4（P=0.0161）的mRNA水平分別顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.4 肝臟組織中胰島素信號通路的表達：胰島素信號通路先前已有描述[12]。胰島素可以通過胰島素受體（Insulin receptor，IR）依次激活胰島素受體底物（Insulin receptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl inositol kinase 3，PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和葡萄糖轉運蛋白4（Glucose transporters 4，GLUT4），導致GLUT4定位于細胞膜。肝臟在維持血糖水平及身體功能方面起著重要作用。PCR結果顯示，與對照組相比，IR（P=0.0003）、PI3K（P=0.0061）、AKT（P=0.0004）和GLUT4（P=0.0033）基因表達分別顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

3? 討論

肥胖被不僅被認為是脂肪肝的危險因素，同時與2型糖尿病也具有一定相關性。脂肪的大量堆積可以引起脂肪組織和肝臟組織的代謝異常，從而引起脂肪和肝臟的胰島素抵抗[7]。本實驗采用高脂飼料喂養的方法，來構建肥胖并伴有胰島素抵抗的大鼠模型。高脂飼料喂養大鼠9周之后，根據實驗所得Lee指數和禁食過夜后大鼠的空腹血糖、空腹胰島素及HOMA-IR水平的相關數據可知，本研究成功構建了肥胖伴有胰島素抵抗大鼠模型。

TNF-α是一種由脂肪細胞和炎癥細胞分泌的細胞因子，與肥胖和2型糖尿病的發生相關。近期一項臨床研究表明，肥胖伴2型糖尿病患者的血清中TNF-α水平明顯升高[8]。本實驗發現，肥胖大鼠的肝臟組織中TNF-α的基因水平明顯升高。因此，我們推測肥胖可能通過上調肝臟組織中TNF-α分泌，從而影響肝臟代謝功能。

GLUT4是一種胰島素調節的葡萄糖轉運蛋白，通常在低胰島素條件下發現于脂肪和肌肉細胞中。然而，高水平的胰島素可以誘導胞內小泡的GLUT4向質膜移位，增加細胞攝取更多葡萄糖[9]。PI3K在胰島素誘導的葡萄糖攝取中起重要作用。大量研究表明，PI3K/AKT信號通路是正常代謝所必需的，并且其不平衡導致肥胖和2型糖尿病的發生[10]。PI3K由IRS上調，胰島素受體底物結合并激活其下游效應因子AKT，導致GLUT4轉運至細胞膜。GLUT4在胰島素誘導的肌肉和脂肪組織葡萄糖提取中起關鍵作用。在糖尿病前期和糖尿病中，GLUT4的表達/易位被檢測到減少，參與了損害血糖控制的機制[11]。身體各種組織中受損的PI3K/AKT信號通路可以導致肥胖和2型糖尿病，進而引起胰島素抵抗;反之，胰島素抵抗可以抑制PI3K/AKT途徑，形成惡性循環[12]。PI3K/AKT信號通路與肝臟胰島素相關，綠色巴西棕櫚提取物可以通過調節PI3K/AKT信號通路，進而提高胰島素敏感度，改善肝臟胰島素抵抗[13]。本實驗發現，高脂喂養大鼠中肝臟組織中胰島素受體、PI3K、AKT和GLUT4基因表達顯著降低。因此，筆者推測：高脂飲食喂養，可以促進肝臟組織中TNF-α的表達，進而抑制PI3K、AKT、GLUT4的表達，從而引發胰島素抵抗。炎癥因子介導的PI3K/AKT信號通路在胰島素抵抗的發生發展中發揮重要作用，這為胰島素抵抗的治療提供了新的治療思路。

本實驗結果顯示長期高脂飲食可以通過抑制胰島素相關信號通路，降低肝臟組織對胰島素敏感度，從而誘發大鼠胰島素抵抗。但是關于肝臟組織在胰島素抵抗中發揮的作用還需要進一步探究。

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[收稿日期]2020-10-15

本文引用格式：范向寧，劉柯，朱久育，等.炎癥因子對肥胖大鼠肝臟組織胰島素信號通路的影響研究[J].中國美容醫學，2021，30（12）：102-104.