仿生識別傳感器的制備及其在抗生素檢測中的應(yīng)用

張磊，鄧健康，張富源

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；3.衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北衡水053000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

動物源性食品，比如肉、蛋和奶等，作為磷和蛋白質(zhì)的主要來源，是人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹匾M成部分[1]。眾所周知，抗生素作為一大類用于治療和預(yù)防細菌感染、促進動物生長的天然產(chǎn)生或人工合成的化學(xué)物質(zhì)，在畜牧業(yè)中被廣泛使用。然而，抗生素在畜牧業(yè)中的不當(dāng)使用以及普遍存在的預(yù)防性添加現(xiàn)象，導(dǎo)致動物源性食品中可能存在抗生素殘留問題。這一方面會引起細菌耐藥性的增加，另一方面又會造成動物源性食品安全問題，進而對人體健康造成威脅[2]。更為甚者，隨著進出口產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)以及全球化的推動，抗生素耐藥性及其污染正快速成為全世界普遍關(guān)注的焦點問題[3]。為降低細菌耐藥性的危害，除了禁止使用一些抗微生物生長促進劑以外，歐盟和美國等國家和地區(qū)還對可用抗生素制定了最大殘留限量（maximum residue levels，MRLs），以確保消費者的飲食安全。我國于2019 年頒布了最新的食品中獸藥殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[4]，其中詳細規(guī)定了在動物源性食品中抗生素最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)以及不得檢出的抗生素種類，是我國現(xiàn)行的食品中抗生素的MRLs 標(biāo)準(zhǔn)。動物源性食品中抗生素殘留具有基質(zhì)復(fù)雜和痕量存在的特點。因此，開發(fā)具有簡單快速、靈敏度高和可靠性強等優(yōu)點的檢測手段，對動物源性食品中的抗生素殘留加以限制，具有非常重要的研究價值和現(xiàn)實意義，是保證動物源性食品安全的有效途徑。

目前，用于抗生素殘留檢測的常規(guī)方法包括微生物法、色譜法和免疫法。微生物法主要是基于抗生素對細菌的抑制作用，包括試管測試、平板測試等。這些方法成本低，但耗時、不準(zhǔn)確，并且對某些抗生素還不夠敏感。色譜法是目前最常規(guī)的經(jīng)典分析方法，包括高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC），氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）以及薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）等。這些方法具有很高的靈敏度和選擇性，但也存在樣品預(yù)處理復(fù)雜、需要精密大型儀器和專業(yè)測試人員等缺陷，限制了它們在現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用[5]。免疫方法是一種基于互補抗體作為選擇性試劑的分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）、電化學(xué)免疫分析（electro chemiluminescence immunoassay，ECI）和膠體金免疫層析法（gold immuno-chromatographic assay，GICA），具有快速、靈敏、準(zhǔn)確以及高選擇性等優(yōu)點，已被廣泛用于抗生素的高通量快速檢測，但也存在抗體制備復(fù)雜困難、難以保存以及動物倫理問題等不足[6]。

近年來，生物傳感器的開發(fā)引起了研究者們極大的興趣。與傳統(tǒng)方法相比，其主要優(yōu)勢在于方法簡單、成本低、靈敏度高以及特異性強等，可對樣品進行原位和實時檢測。20 世紀(jì)80 年代，生物傳感器逐漸開始應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域[7]。近年來，隨著各種仿生分子識別技術(shù)的成功開發(fā)，研究者們制備了大量具有高度選擇性和適用性的新型生物傳感器，使其逐漸成為食品安全以及其他許多分析領(lǐng)域中簡單、快速和低成本檢測抗生素的重要手段[8-9]。但是，現(xiàn)有的生物傳感器方法還需要在諸如靈敏度、特異性、便攜性、低成本、高通量以及商業(yè)化上不斷改進，以滿足廣大群眾對抗生素日常檢測的迫切需求。所以，基于上述原因，非常有必要對生物傳感器在抗生素殘留檢測方面的最新研究進行全面綜述，以利于研究者們下一步的工作。

本文對近幾年來用于抗生素檢測的常見生物傳感器進行了分類綜述，其中著重分析了主要仿生受體和換能器的基本原理及其優(yōu)缺點，以及它們在抗生素殘留檢測中的應(yīng)用。最后，還對仿生識別手段的發(fā)展前景進行了展望。

1生物傳感器

生物傳感器是一種能將生物響應(yīng)轉(zhuǎn)換為電信號的分析設(shè)備，它主要由兩部分組成：識別元件和換能器。其中，識別元件負責(zé)特異性識別與結(jié)合目標(biāo)分析物，換能器負責(zé)將分析物結(jié)合或轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的化學(xué)信號轉(zhuǎn)換成易于量化的輸出信號[10]。它可以實現(xiàn)分析儀器的小型化，并表現(xiàn)出與傳統(tǒng)分析技術(shù)相當(dāng)?shù)撵`敏度和選擇性。這在食品安全檢測中非常必要。

1.1 識別元件

1.1.1 生物受體

生物傳感器中傳統(tǒng)的識別元件主要是一些具有分子識別能力的生物分子，包括：抗體、酶、核酸、細胞以及基于它們的半合成受體等。

抗體是最為常用的生物受體，其優(yōu)點主要在于它們的高度敏感性和特異性。然而，其固有的一些缺陷，比如：穩(wěn)定性差、成本高、動物倫理問題以及非特異性結(jié)合等，限制了它們在食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。酶生物傳感器可測量特定目標(biāo)物對酶的選擇性抑制或催化作用，也被用于檢測食品和環(huán)境樣品中的一些污染物，但多集中于對除草劑的分析，而關(guān)于抗生素檢測的報道很少[11]。核酸（DNA 和RNA）作為識別元件，在化學(xué)性質(zhì)上比抗體更為穩(wěn)定。在核酸傳感器中，DNA（或RNA）識別元件與靶DNA（或RNA）序列的特定區(qū)域能通過堿基配對形成探針-靶標(biāo)復(fù)合物，最終實現(xiàn)識別元件對目標(biāo)物的特異性識別[12]。細胞生物傳感器能滿足多種分析物高通量同時檢測的需要。然而，它存在費時、耐用性差以及樣品基質(zhì)成分的非特異性吸附等問題[13]。另外，基于常用的天然生物受體，研究者們還嘗試開發(fā)了多種半合成生物受體，比如：重組抗體[14]、噬菌體展示抗體庫[15]和親和體[16]等。

生物受體以及半合成生物受體因其優(yōu)異的特異性識別能力，在許多領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。但是，它們存在制備困難、成本高以及穩(wěn)定性差等固有缺陷，這極大地限制了它們在食品安全分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1.1.2 仿生識別元件

近年來，仿生識別（biomimetic recognition）元件作為生物受體的有效替代品，因其相對于生物受體的諸多優(yōu)勢，引起了研究者們極大的興趣。與生物受體相比，仿生識別元件可通過體外制備的方法來合成，這不僅有效避免了生物受體對實驗動物的繁瑣工作，而且還能減少識別元件的批次間差異性。更為重要的是，制備的仿生識別元件具有識別非免疫原性分子的能力，使其更適合于小分子目標(biāo)物的檢測。近年來，研究者們通過將分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）和核酸適配體（aptamers）等仿生識別手段引入到生物傳感器中，利用它們易制備、低成本的優(yōu)點，以及惡劣環(huán)境條件下（例如：酸或堿條件、有機溶劑，或高溫高壓等）的高穩(wěn)定性和可重復(fù)性，有效地拓寬了生物傳感器在食品安全分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1.1.2.1 MIPs

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technique，MIT）是一種重要的仿生分子識別技術(shù)。它是基于“抗原-抗體”學(xué)說建立的一種可與目標(biāo)物高選擇性結(jié)合的極為有效的方法。該技術(shù)通過化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)將模板分子與功能單體合成穩(wěn)定的MIPs，在除去目標(biāo)分子以后，聚合物中保留了具有特定形狀、結(jié)構(gòu)和官能團的互補空腔，它們可以高選擇性地識別目標(biāo)物及其類似物[17]。與天然抗體相比，MIPs 具有穩(wěn)定性強、對苛刻條件（例如：不同溶劑）的耐受性強、制備方法簡單、成本低、可重復(fù)使用以及目標(biāo)物通用性強（例如：抗生素和農(nóng)藥等）等優(yōu)勢。所以，它非常適合于構(gòu)建各種生物傳感器，并且表現(xiàn)出準(zhǔn)確、高效、靈敏度高且生物相容性好等特點[18]。

1.1.2.2 aptamers

aptamers 作為一種單鏈DNA 或RNA 寡核苷酸，可以特異性結(jié)合多種不同類別的靶分子，包括：小分子（比如：核苷酸、氨基酸、金屬離子和其他小分子）、大分子（比如：肽、多糖和蛋白質(zhì)），以及各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)（比如：完整細胞、病毒和單細胞生物）等，具有低分子量、易修飾、合成簡單、穩(wěn)定性好、高親和力、高穩(wěn)定性、高選擇性和高敏感性等優(yōu)點[19]。

與抗體相比，適配體的優(yōu)勢主要為：（1）化學(xué)穩(wěn)定性高，對pH 值的變化不敏感，可在環(huán)境溫度下長期保存；（2）變性高度可逆，可在高溫下變性并在低溫下復(fù)性；（3）合成簡單，可在體外進行非生物篩選并以高純度合成；（4）可識別多種靶標(biāo)，包括小分子、大分子以及各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)等；（5）具有高度親和力，對目標(biāo)物的解離常數(shù)（Kd）在10-6mol/L～10-12mol/L 之間；（6）易于修飾并且適合與納米材料組合。基于以上優(yōu)點，aptamers作為抗體的有效替代者被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生物分析等領(lǐng)域[20]。

1.2 換能器

根據(jù)換能器的不同，生物傳感器可分為：光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)量敏感以及其他生物傳感器等。其中，尤以光學(xué)和電化學(xué)生物傳感器在食品分析中應(yīng)用最為廣泛。

1.2.1 光學(xué)

光學(xué)檢測可捕獲由識別元件與目標(biāo)分析物相互作用產(chǎn)生的信號，并將其轉(zhuǎn)換為光信號。近年來，光學(xué)生物傳感器由于其操作簡便、響應(yīng)速度快和靈敏度高等優(yōu)點而被廣泛用于抗生素檢測。1995 年，Sternesjo等[21]首次制備了基于表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）的高靈敏度生物傳感器用于抗生素檢測，這為抗生素的光學(xué)免疫測定奠定了基礎(chǔ)。隨著熒光納米材料的發(fā)展，其在熒光傳感器中的應(yīng)用越來越多。2006 年，Ding 等[22]第一次采用基于量子點（semi?onductor quantum dots，QDs）的熒光免疫分析法進行抗生素檢測。另外，Tan 等[23]設(shè)計一種基于氧化石墨烯（graphene oxide，GO）水凝膠的熒光分析方法用于土霉素（oxytetracycline，OTC）檢測。

1.2.2 電化學(xué)

電化學(xué)檢測是基于化學(xué)反應(yīng)引起的電子或離子測量值變化，從而導(dǎo)致溶液電參數(shù)變化的原理。它具有高靈敏度、高選擇性、低成本和易于操作等優(yōu)點[24]。電化學(xué)生物傳感器主要分為四類：電流型、阻抗型、伏安型和光電化學(xué)型。近年來，許多納米材料已被整合到電化學(xué)傳感器中，以改善其檢測性能。例如，Gon?alves 等[25]利用半胱氨酸自組裝單層膜將青霉素酶固定在金電極上，制備了一種電流型電化學(xué)傳感器用于青霉素G（benzylpenicillin，penicillin G）的檢測。Liu 等[26]提出一種的基于金電極修飾的羧基-Fe3O4磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）的阻抗型電化學(xué)免疫傳感器，用于四環(huán)素（tetracycline，TC）的檢測。Zhou 等[27]構(gòu)建了一種多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）修飾的基于循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）和微分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）的電化學(xué)傳感器，用于TC 檢測。Li 等[28]提出了一種水分散性類石墨氮化碳（waterdispersible graphite-like carbon nitride，w-g-C3N4）作為光敏材料的光電化學(xué)（photoelectrochemical，PEC）適配體傳感器，用于特異性檢測卡那霉素（kanamycin，KAN）。

1.2.3 其他換能器

近年來，表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）由于其具有簡單、快速、高靈敏度以及無需樣品預(yù)處理等優(yōu)點，被廣泛用于構(gòu)建生物傳感器。例如，Yang 等[29]提出了一種基于競爭性免疫測定和磁分離的SERS 生物傳感器，用于氯霉素（chloramphenicol，CAP）的檢測。另外，研究者們還制備出基于質(zhì)量敏感檢測的壓電生物傳感器，用于抗生素的現(xiàn)場實時檢測。例如，Karaseva 等[30]提出了一種基于MIPs 的壓電生物傳感器，用于檢測青霉素G。

2 仿生生物傳感器在抗生素檢測中的應(yīng)用

2.1 基于MIPs 的仿生生物傳感器

近年來，MIPs 因其快速、準(zhǔn)確和成本低的特點，并具有能有效分離復(fù)雜樣品組分、選擇性識別目標(biāo)物并進行富集、簡化前處理過程以及降低檢出限等優(yōu)點，其在食品安全分析檢測中的應(yīng)用越來越多。Jia 等[31]以4-硝基甲苯（4-nitrotoluene，NT）為虛擬模板，合成了對CAP 具有高度特異性的MIPs，通過化學(xué)發(fā)光的方法測定肉中的CAP 含量，其檢出限（limit of detection，LOD）低至5.0 pg/g。Jiang 等[32]以米諾環(huán)素（minocycline）為模板，以雙（2，4，6-三氯苯基）草酸酯-過氧化氫-咪唑[bis（2，4，6-trichlorophenyl）oxalate-hydrogen peroxideimidazole]化學(xué)發(fā)光體系啟動光信號，制備了用于檢測5 種四環(huán)素類抗生素的化學(xué)發(fā)光傳感器，表現(xiàn)出簡單、快速、靈敏及可重復(fù)性的優(yōu)點。Long 等[33]基于磁性MWCNTs，構(gòu)建了一種磁性印跡電化學(xué)傳感器，用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量KAN 的靈敏測定。Song 等[34]使用電聚合MIPs 修飾的Au-Ag 合金微棒（alloy microrod，AMR）作為工作電極，對甲硝唑（metronidazole，MNZ）進行超靈敏的電化學(xué)檢測，表現(xiàn)出很好的特異性和抗干擾能力。另外，Ebarvia 等[35]提出了一種基于MIPs 和壓電石英晶體的傳感器，成功用于牛奶、蜂蜜和蝦等食品中CAP 的檢測。

2.2 基于適配體的仿生生物傳感器

通常，適配體與不同載體結(jié)合，可構(gòu)建復(fù)合探針和電化學(xué)傳感器。前者用aptamers 和微載體（如QDs、CDs 和AuNPs）制備，具有易于制備、方法檢出限（limit of detection，LOD）低（可低至nmol/L 水平）等優(yōu)點；后者由適配體和電化學(xué)電極制成，這種方法通常制備過程很耗時，但是檢測限更低（可降至pmol/L 甚至fmol/L水平）。

近年來，已開發(fā)出一些“適配體傳感器”來檢測動物源性食品中的抗生素殘留，例如：CAP、TC、KAN、鏈霉素（streptomycin，STR）、氨芐西林（ampicillin，AMP）以及磺胺二甲氧嘧啶（sulfamethazine，SMZ）等。Javidi等[36]采用完整的長序列aptamer 作為識別元件，短序列寡核苷酸作為與適配體末端片段互補的鎖定探針（locker probe，LP），構(gòu)建了基于AuNPs 的比色適配體傳感器，用于牛奶中CAP 的檢測。結(jié)果顯示，該方法表現(xiàn)出簡單、靈敏且優(yōu)異選擇性等優(yōu)點。Ouyang 等[37]開發(fā)了一種基于aptamers 的上轉(zhuǎn)換納米聚粒（NaY0.48Gd0.3F4：Yb0.2，Ho0.02）生物傳感器，成功用于牛奶、豬肉等實際樣品中TC 的檢測。He 等[38]開發(fā)了一種由氧化石墨烯量子點（graphene oxide quantum dots，GOQDs）標(biāo)記的aptamers 作為熒光供體，GO 作為淬滅劑的熒光“開/關(guān)”傳感器，用于牛奶樣品中SMZ 的檢測。Qin 等[39]基于硫氨酸官能化石墨烯（thionine functionalized graphene，GR-TH）和分層納米孔（hierarchical nanoporous，HNP）PtCu 合金作為生物傳感基質(zhì)構(gòu)建了一種新型電化學(xué)適配體傳感器，用于動物源性食品（豬肉和雞肝）中KAN 的檢測。Xu 等[40]通過一鍋法合成了一種新型的CdTe 量子點-單壁碳納米角（CdTe quantum dots-single walled carbon nanohorns，CdTe-SWCNHs）納米復(fù)合材料，以其作為光敏材料、適配體作為識別元件，構(gòu)建了PEC 適配體傳感器，并成功用于蜂蜜樣品中STR 的檢測。Wang 等[41]構(gòu)建了一種基于DNA 適配體功能化的AuNPs 和單鏈DNA 結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding protein，ssDNA-BP）的電化學(xué)傳感器，成功用于牛奶等實際樣品中AMP 的檢測。

3 新型仿生識別手段及其發(fā)展前景

3.1 新型仿生識別手段

近年來，基于識別元件在生物傳感器中的重要地位，研究者們開發(fā)了多種新型仿生識別受體，以滿足對生物傳感器快速診斷和改善檢測性能（包括：選擇性、穩(wěn)定性以及成本效益等）的要求。

1）序列優(yōu)化適配體（sequence-optimized aptamers）。通過優(yōu)化適配體序列，使適配體-目標(biāo)物的識別引起更大的構(gòu)象變化，以提高檢測體系的靈敏度。例如，Schoukroun-Barnes 等[42]通過改進電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號和適配體序列突變用于氨基糖苷類抗生素的檢測，結(jié)果顯示檢測限降低了100 倍。

2）催化性MIPs（catalytic MIPs）。MIPs 既作為識別元件，又作為檢測化學(xué)信號的酶。例如，Gu 等[43]以三聚氰胺為功能單體和模擬酶成分，成功合成了具有類似硝基還原酶活性的MNZ 印跡聚合物。

3）脂質(zhì)體（liposomes）。脂質(zhì)體通過與聚二乙炔（polydiacetylenes，PDA）表面偶聯(lián)，可用于氨基糖苷類抗生素的檢測。例如，Kang 等[44]模仿新霉素（neomycin）和磷脂之間細胞膜相互作用的機制，構(gòu)建了脂質(zhì)體與PDA 表面偶聯(lián)的生物傳感器，成功用于氨基糖苷類抗生素的檢測。

4）納米酶（nanozyme）。納米酶[45-46]不僅具有與天然生物酶相仿的催化活性，而且比后者更強大、更穩(wěn)定，且成本更低。例如，Sharma 等[46]結(jié)合AuNPs 固有的過氧化物酶活性與aptamers 的高親和力和特異性，構(gòu)建了一種新型熒光“關(guān)/開”生物傳感器，可有效用于KAN 的檢測。

3.2 發(fā)展前景

仿生識別受體具有易制備、低成本、高穩(wěn)定性和可重復(fù)性等優(yōu)點，它能滿足未來對生物傳感器小型化、高通量以及現(xiàn)場檢測的潛在要求[47]。因此，隨著生物傳感器在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛，系統(tǒng)研究基于仿生識別的生物傳感器顯得尤為重要。

目前，除了開發(fā)新型仿生識別受體以外，針對仿生識別受體的研究主要集中于以下幾個方面：

1）仿生識別受體組合。通過將多種仿生識別受體組合使用，不僅可以提高檢測的特異性和靈敏度，而且還能實現(xiàn)單一樣品的多重檢測，大大提升了檢測的效率和便利性。

2）與納米材料結(jié)合。納米材料具有較大的比表面積，可充當(dāng)固定化載體、信號放大器、磁性分離器等，與仿生受體結(jié)合使用，可開發(fā)出更具選擇性和敏感性的生物傳感器[48-49]。

3）實際樣品適用性。一般情況下，仿生識別受體的選擇性受實際樣品條件的影響，包括：干擾組分（例如：脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素和碳水化合物）、離子強度、pH 值和黏度等。而且，受體與樣品組分之間的非特異性相互作用還可能導(dǎo)致結(jié)果的假陽性。因此，在大多數(shù)生物傳感器中，都需要對樣品進行預(yù)處理。通過盡可能簡化樣品預(yù)處理過程，可以更好地滿足實際和復(fù)雜樣品中特定目標(biāo)物的檢測。

4）商業(yè)應(yīng)用。仿生識別元件（比如：MIPs 和aptamers）的主要局限在于它們的商業(yè)開發(fā)仍處于起步階段。近年來，研究者們開發(fā)了一些可商購生物傳感器用于抗生素檢測。但是還存在穩(wěn)定性不足、不夠廉價以及無法實現(xiàn)多重檢測等問題。因此，用于抗生素檢測的生物傳感器仍是亟待建立的潛在市場，并且與其他生物傳感領(lǐng)域相比，該領(lǐng)域的研究還很不夠。