響應面法優化艷山姜多糖提取工藝及抗氧化研究

魏晴，盧虹志，張俊，梁珊珊，3，薛娟*

（1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽550025；2.貴州中醫藥大學大果木姜子研究中心，貴州貴陽550025；3.貴州中醫藥大學植物多糖研究中心，貴州貴陽550025）

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥成熟果實，始見于《植物名實圖考》，廣泛分布在我國西南地區[1-2]。艷山姜具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧的功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀，已被收錄于2003 版《貴州省中藥、民族藥標準》[3]。艷山姜用于治療胃潰瘍，在水族的民間應用已經有數百年歷史，且效果顯著[3-4]。此外，在貴州，艷山姜莖、葉和果實也作為一種食品應用于日常生活中。因此艷山姜作為“藥食同源”植物的開發研究具有極大的價值。

近年來研究主要集中在艷山姜抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、抗炎、鎮痛和降壓等藥理作用上，而對艷山姜成分及提取工藝的研究幾乎為空白[5-8]。艷山姜抗氧化活性的研究中，僅對葉的醇提物成分進行了研究，對其它藥用部位以及成分研究未見報道[9-10]。因此本文采用響應面分析法優化艷山姜多糖的提取工藝，并比較了不同藥用部位多糖的抗氧化活性，填補了艷山姜成分及提取工藝研究的空白，為艷山姜這一特色“藥食同源”植物的開發提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV721 型紫外可見分光光度計：上海平軒科學儀器有限公司；BSA124S 電子分析天平：賽多利斯儀器有限公司；KQ-500DE 超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

葡萄糖標準品（批號：MB6951）：大連美侖生物技術有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma 公司；其它化學試劑均為分析純試劑。

1.2 材料

艷山姜：華夏藥業有限責任公司，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt et Smith 的干燥成熟根莖。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

將新鮮的艷山姜置于陰涼處晾干，除去雜質，用粉碎機粉碎，過40 目篩，即得艷山姜粉末。

1.3.2 超聲輔助提取的單因素試驗

分別稱取艷山姜粉末5 g，按照液料比30∶1（mL/g），超聲功率70 W，考察提取時間分別為30、35、40、45、50 min 時對多糖得率的影響；按照液料比30∶1（mL/g），提取時間40 min，考察超聲功率分別為50、60、70、80、90 W 時對多糖得率的影響；按照超聲功率70 W，提取時間40 min，考察液料比分別為20∶1、30：1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）時對多糖得率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，對3 個影響因素進行三因素三水平試驗，以多糖得率作為評價指標，探究艷山姜多糖的最佳提取工藝條件。利用Design Expert 10.0.7 軟件進行分析，建立數學回歸模型，以得到最佳的提取工藝，表1 為響應面因子水平。

表1 響應面設計試驗因素水平及編碼Table 1 Response surface design test factor level and coding

1.3.4 多糖含量的測定

1.3.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制標準曲線的繪制參考文獻[11-12]。得到線性回歸方程為：Y=8.043 1x+0.074 5，R2=0.999 3。

1.3.4.2 樣品多糖得率的測定

超聲輔助提取后將提取液冷卻至25℃，以4 000r/min離心2 次，每次15 min，分離上清液，在上清液中加入無水乙醇（最終乙醇濃度至80%），4 ℃冰箱內過夜，以4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，50 ℃干燥至恒重，即得艷山姜多糖。分別稱取10 mg 艷山姜多糖，加入10 mL 蒸餾水，配制成1 mg/mL 的艷山姜多糖溶液。每份溶液各取0.1 mL，分別加入蒸餾水0.9 mL，將其稀釋100 倍后分別加入1 mL 苯酚搖勻，迅速加入5 mL 濃硫酸搖勻，冷卻至室溫（25 ℃），測定其吸光值，根據標準曲線計算供試液中葡萄糖的含量，再按下式計算樣品中多糖得率：多糖得率/%=C×D/W×10。式中：C 為樣品中葡萄糖濃度，mg/mL；D 為樣品溶液稀釋倍數；W為樣品的質量，g。

1.3.5 艷山姜多糖抗氧化活性研究

1.3.5.1 樣品的前處理

分別取艷山姜粉末10 g 在提取時間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g）條件下提取多糖，得到母液濃度為25 mg/mL，然后取160 μL 母液置于10 mL容量瓶中，余下部分用蒸餾水補足，得到400 μg/mL 溶液，再將溶液對半稀釋，分別得到50、100、200、400 μg/mL的各待測樣品溶液。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測定

參照文獻的方法[13-14]，分別準確吸取不同濃度待測樣品2 mL，再吸取2 mL DPPH 標準乙醇溶液加入到10 mL 的試管中搖勻，室溫（25 ℃）下避光靜置30 min后測定其在517 nm 處的吸光值。每個待測樣品平行測定3 次，取平均值。按照如下公式計算清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ao為2 mL 樣品溶劑與2 mL DPPH 混合反應后的吸光值；Ai為2 mL 樣品與2 mLDPPH 混合反應后的吸光值；Aj為2 mL 樣品與2 mL 乙醇混合反應后的吸光值。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基的清除能力測定

參照文獻的方法并進行修改[15-16]，在420 nm 處測定吸光值，每隔30 s 測一次，記錄樣品在300 s 內的吸光值，最后計算線性范圍內的吸光值每分鐘的增加值。將所得的各個吸光值帶入如下公式，求出不同濃度樣品對于超氧陰離子自由基的清除率。

超氧陰離子自由基清除率/%=[（ΔAo-ΔA）/ΔAo]×100

式中：ΔAo為鄰苯三酚在300 s 內每分鐘吸光值的增加值；ΔA 為樣品溶液在300 s 內每分鐘吸光值的增加值。

1.3.5.4 羥基自由基的清除能力測定

參照張淑杰等的方法[17]，在37 ℃恒溫水浴鍋中溫浴60 min，在536 nm 處測其吸光值，分別記錄吸光值。將所得的各個吸光值帶入如下公式求出不同濃度樣品對于羥基自由基的清除率。

羥基自由基清除率/%=[A樣-A損]/[A未-A損]×100

式中：A樣為用不同濃度待測樣品1 mL 代替1 mL雙蒸水測得吸光值；A損為加入1 mL 0.01%的過氧化氫溶液后測定的吸光值；A未為用1 mL 蒸餾水代替1 mL 0.01%過氧化氫測定的吸光值。

1.4 數據處理

將測得的數據用SPSS 17.0 軟件進行統計計算，運用Design-Expert10.0.7 軟件進行響應面優化分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

提取時間對艷山姜多糖得率的影響見圖1。

圖1 提取時間對艷山姜多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield of Alpinia zerumbert polysaccharides

由圖1 可知，提取時間為30 min ～50 min 時，艷山姜多糖得率在35 min 達到最高值5.25%，提取時間為40 min 時多糖得率顯著下降，原因可能是隨著提取時間延長，其它成分也被提取出來，使得多糖含量下降，而40 min 后溶液達到飽和，無更多成分被提取出來，因此多糖得率無顯著變化。

超聲功率對艷山姜多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對艷山姜多糖得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides

由圖2 可知，超聲功率為50 W～90 W 時，艷山姜多糖得率在70 W 達到最高值4.28%，當超聲功率增大到80 W 時多糖得率顯著下降，可能原因是高強度的超聲波剪切作用使得部分糖鍵斷裂，使得多糖含量下降。

液料比對艷山姜多糖得率的影響見圖3。

由圖3 可知，液料比為20∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）時，艷山姜多糖得率在40∶1（mL/g）時達到最高值4.19%，當液料比超過40∶1（mL/g）后多糖得率下降，過高液料比導致多糖得率下降可能是因為隨著溶劑量的增大，可溶性物質溶出增大，雜質含量增高，某些未知成分可能導致部分多糖的分解。

圖3 液料比對艷山姜多糖得率的影響Fig.3 The effect of liquid-material ratio on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides

2.2 響應面方案與試驗結果

利用響應面軟件Design Expert 10.0.7 設計三因素三水平的試驗，設計方案見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

對模型數據進行回歸擬合，得到自變量提取時間（A）、超聲功率（B）、液料比（C）與艷山姜多糖得率（Y）的二次多元回歸方程：Y=5.55+0.16A+0.10B+0.091C-0.18AB-0.23AC-0.012BC-1.77A2-0.62B2-0.95C2。

表3 響應面二次模型多糖得率的方差和回歸系數分析Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

由表3 可知，A、AC、A2、B2、C2的P＜0.05，以上因素對多糖得率的影響顯著；B、C、AB、BC 的P＞0.05，以上因素對多糖得率的影響不顯著。由F 值可知，3 個因素對艷山姜多糖得率的影響程度的大小順序為：提取時間＞超聲功率＞液料比。

2.3 響應面分析

當液料比固定為40∶1（mL/g）時，超聲功率與提取時間相互作用見圖4。

圖4 提取時間和超聲功率對多糖得率響應面圖Fig.4 Response surface graph of extraction time and ultrasonic power versus polysaccharide yield

由圖4 可知，在超聲功率一定時，多糖得率隨提取時間先增大然后降低；在提取時間一定時，多糖得率隨超聲功率先增大然后趨于平緩降低，響應面坡度較小，提取時間和超聲功率的交互作用不顯著。

當超聲功率固定為70 W 時，提取時間和液料比相互作用見圖5。

圖5 提取時間和液料比對多糖得率響應面圖Fig.5 Response surface graph of extraction time and liquidmaterial ratio versus polysaccharide yield

由圖5 可知，在液料比一定時，多糖得率隨提取時間先增大后降低；在提取時間一定時，多糖得率隨液料比先增大后降低，響應面坡度陡峭，等高線密集，接近橢圓形，說明提取時間和液料比交互作用顯著。

當提取時間固定為35 min 時，超聲功率和液料比相互作用見圖6。

由圖6 可知，在超聲功率一定時，多糖得率隨液料比先增大然后趨于平緩；在液料比一定時，多糖得率隨超聲功率先增大然后趨于平緩，響應面坡度較小，等高線近圓形，說明液料比和超聲功率的交互作用不顯著，以上結果均這與回歸方程方差分析的結果相符。

2.4 優化與驗證試驗

軟件處理下最優條件為液料比40.12∶1（mL/g）、超聲功率72.86 W、提取時間35.47 min，此條件預測艷山姜多糖得率為5.45%。根據實際操作條件，將最佳提取工藝修正為：提取時間35 min、超聲功率為70 W、液料比為40∶1（mL/g），得到實測多糖得率為5.37%。實際值與預測值之間相差小于0.1%，偏差較小，驗證了該響應面模型的有效性。因此，響應面法對艷山姜多糖最佳優化工藝為提取時間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g）。

2.5 艷山姜多糖抗氧化活性結果

艷山姜多糖抗氧化作用見表4。

表4 艷山姜多糖抗氧化作用Table 4 Antioxidant effect of Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith polysaccharide

2.5.1 艷山姜多糖對DPPH 自由基清除作用

當濃度在50 μg/mL ～300 μg/mL 時，艷山姜多糖各濃度對DPPH 自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現出明顯的量效依賴線性關系，當濃度大于300 μg/mL時，艷山姜多糖對DPPH 自由基的清除率基本保持不變，當濃度為400 μg/mL 時，艷山姜多糖對DPPH 自由基的最大清除率為93.17%，因此，艷山姜多糖對DPPH自由基有一定的清除作用。

2.5.2 艷山姜多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

當濃度在50 μg/mL～400 μg/mL 時，艷山姜多糖各濃度對超氧陰離子自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現出明顯的量效依賴線性關系。當濃度為400 μg/mL時，艷山姜多糖對超氧陰離子自由基最大清除率為92.07%。因此，艷山姜多糖對超氧陰離子自由基有一定的清除作用。

2.5.3 艷山姜多糖對羥基自由基的清除作用

當濃度在50 μg/mL～400 μg/mL 時，艷山姜多糖對羥基自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現出明顯的量效依賴線性關系。當濃度為400 μg/mL 時，艷山姜多糖對羥基自由基的最大清除率為90.17%。因此，艷山姜多糖對羥基自由基有一定的清除作用。

由以上結果可知，艷山姜多糖有一定的抗氧化活性，在一定范圍內具有濃度依賴性。近年研究表明，多糖一方面可直接作用于抗氧化酶，通過提高如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，發揮抗氧化作用。此外，多糖還能夠與產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）所需的金屬離子絡合[18]。多糖含有多個羥基，這些羥基可以與Fe2+和Cu2+等產生自由基所需的金屬離子絡合，抑制了自由基的產生，影響了脂質的過氧化反應的起始，并最終抑制了ROS 的產生[19]。另一方面，多糖可以直接作用于自由基，可以直接捕獲在脂質過氧化鏈式反應中產生的ROS，阻斷或減慢脂質過氧化。對于羥基自由基，多糖鏈上的氫原子可與它們結合產生水，達到去除羥基自由基的目的。對于超氧陰離子自由基，多糖類可以引起氧化反應，從而達到清除的目的[20]。

3 結論

本試驗利用超聲輔助提取法獲得艷山姜多糖，進一步通過響應面法優化了多糖的提取工藝。結果表明，影響艷山姜多糖得率的順序為：提取時間（A）＞超聲功率（B）＞液料比（C）。艷山姜多糖最佳超聲輔助提取工藝條件為：提取時間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g），在此工藝條件下，艷山姜多糖得率為5.37%。本研究首次對艷山姜多糖提取工藝進行研究，并優化了多糖的提取工藝。此外，艷山姜多糖具有較強的抗氧化能力。

綜上所述，超聲輔助提取艷山姜多糖的優化工藝可行，且艷山姜多糖有較強的體外抗氧化能力，本研究為艷山姜產品的研究與開發提供理論依據。