天然食用色素藻藍蛋白研究進展

任順成，曹悅，李林政，潘天義

（1.河南工業大學河南省天然色素制備重點實驗室，河南鄭州450001；2.河南中大恒源生物科技股份有限公司，河南漯河462600）

螺旋藻是一種具有高營養價值和生物利用價值的水生植物，常用于動物飼料[1]及化妝品領域[2]，富含的優質蛋白及天然色素成分使其在食品領域備受關注[3-4]。螺旋藻中藻膽蛋白根據吸收光譜不同主要分為藻藍蛋白、別藻藍蛋白及藻紅蛋白。其中藻藍蛋白（phycocyanin，PC）又稱藻藍色素，是水溶性植物蛋白[5]，據其來源可分為：C-phycocyanin（從藍藻中獲得）、R-phycocyanin（從紅藻中獲得）和R-phycocyaninII（從共生球菌中獲得）[6]。藻藍蛋白的藍色是因為其蛋白質部分通過硫醚鍵連有四吡咯發色團，目前研究認為藻藍蛋白含兩條相對同源的多肽鏈α 和β，連接有3 個發色團，分別位于α 亞基的Cys84 和β 亞基的Cys84、Cys155，α、β 亞基通過分子間相互作用力先形成單體（αβ），其亞基聚集形式受環境影響，多呈單聚體、三聚體和六聚體[7-8]。藻藍蛋白是一種高營養的植物提取物，同時具有蛋白質的特性，可作為天然色素用于食品、化妝品等，同時因其熒光特性可制成熒光試劑、探針、示蹤物質等，已用于臨床醫學、免疫學、生物學領域。近年來研究還表明，藻藍蛋白具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌性等功能活性，可作為藥物成分用于醫療保健，同時還是一種無毒副作用的理想光敏劑[9-11]。因此，藻藍蛋白無論作為天然色素還是功能活性成分都有重要的研究意義。本文對其提取、純化方法、穩定性及強化方法、生理活性方面做了比較全面的綜述。

1 提取

藻藍蛋白提取重在細胞破碎[12]，目前還沒有標準的提取方法，國內外常用方法包括凍融法、超聲波破碎法、溶脹法、化學試劑法等。HADIYANTO 等[13]以提取率和抗氧化活性（EC50）為響應變量，對超聲波頻率、時間、溫度進行響應面優化。結果表明，超聲波可顯著提高微藻藻藍蛋白提取率，最佳條件為提取溫度52.5℃，超聲頻率42 kHz 下處理42 min，產率可達15.7%，EC50為85.78 mg/mL。張靜等[14]以太湖藍藻為研究對象，以藻藍蛋白的特征吸收峰和濃度為指標，對比反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的提取效果，發現4 種方法均能不同程度地提取得到藻藍蛋白，反復凍融法提取量最高，超聲波法最低，且兩種方法對應的濃度值變異系數＜0.6，綜合比較發現反復凍融法為最優方法。龐曉宇等[15]進一步對液氮反復凍融法中緩沖液的種類進行比較，分別以Asolctin-CHAPS 緩沖液（AC）、磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液來提取藻藍蛋白，AC 和磷酸鹽緩沖液提取效率較為顯著，雖然AC 緩沖液提取效率最高，但其成本昂貴且制備復雜，因此磷酸鹽緩沖液更適用于藻藍提取。此外也有研究將兩種或多種方法結合使用，侯兆乾等[16]對凍融法和超聲法進行單獨優化試驗，在此基礎上采用先凍融再超聲輔助提取藻藍蛋白，發現提取率較兩種方法單獨使用時有顯著提高。俞建峰等[17]采用溶脹法、超細剪切法、超聲波法、反復凍融法及溶脹-超細剪切法、溶脹-超細剪切-超聲波法破壞螺旋藻細胞，最高得率分別為8.9%、7.4%、8.0%、8.3%、9.2%、8.9%，結合操作條件最終選擇溶脹-超細剪切法且溶脹時間12 h，超細剪切時間5 min 可得到最佳破壁效果。胡雙飛[18]采用反復凍融法與超聲均質聯用、超聲耦合亞臨界水提取兩種方法提取螺旋藻藻膽蛋白，并對溫度、超聲功率、時間進行響應面優化，試驗發現采用第一種方法得到的蛋白提取率為45.76%，而優化后超聲耦合亞臨界水提取的螺旋藻藻膽蛋白得率高達74.02%。

2 純化方法

藻藍蛋白根據純度可分為食品級、醫藥級和分析級，目前國內外常用的純化方法包括硫酸銨沉淀法、等電點沉淀法、梯度鹽析法、離子交換柱層析法、羥基磷灰石柱層析法、膨脹床吸附法、雙水相萃取法及多種方法結合使用。

2.1 單一技術純化藻藍蛋白

徐潤[19]采用硫酸銨分級沉淀法和等電點沉淀法純化藻藍蛋白粗提液，比較其純度及回收率。藻藍蛋白的純度和回收率與硫酸銨飽和度呈正相關，飽和度為40%的硫酸銨效果最優，因此得出純化藻藍蛋白最佳硫酸銨飽和度范圍在30%～50%；而等電點沉淀法試驗中，pH3.5 時得到沉淀量最大，但相較于硫酸銨沉淀法其純度和回收率都極低，且試驗中酸度的變化易使藻藍蛋白變性，不推薦此方法。李冰等[20]以鈍頂螺旋藻為原料優化提取純化藻藍蛋白，先用50%硫酸銨沉淀得到粗蛋白提取液，經一次羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）柱層析后純度可達2.56，將得到的藻藍蛋白組分經過Sephacryl HR-200 柱凝膠層析后再次經過HA 柱層析可得到藻藍蛋白的單一洗脫峰，此時純度高達4.71。于淑坤等[21]旨在簡化試劑級藻藍蛋白的純化步驟，首先采用飽和度分別為30%和50%的硫酸銨兩步沉淀法進行沉淀后用0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液透析，第二步將透析后的藻藍溶液加入到HA 柱上進行梯度洗脫，第三步將所得藻藍蛋白純度和含量最高的吸收峰濃縮后二次上柱到DEAE-Sephadex-A-25 層析柱上純化。每步對應的藻藍蛋白純度和提取率分別為0.87和23.6%、2.1 和49.3%、5.4 和63.1%，說明上述步驟能夠獲得試劑級藻藍蛋白，為進一步研究適合工業生產的純化工藝給予理論指導。NASCIMENTO 等[22]將聚乙二醇分別與磷酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉不同質量比混合后，進行雙水相萃取藻膽蛋白，發現用13%聚乙二醇-14%磷酸鉀雙水相體系萃取念珠藻、13%聚乙二醇-14%檸檬酸鈉所組成的雙水相體系萃取變異魚腥藻，二者效果最佳。王勇等[23]通過Sephadex G-200、DEAE-Sephadex A-25、HA、Sephadex G-200 工 序 純化，所得純度值為14 的藻藍蛋白，是目前國內外報道中的最高值。

2.2 復合技術純化藻藍蛋白

張發宇[24]選取分段鹽析、雙水相萃取、層析法3 種方法對巢湖藍藻藻藍蛋白粗提液進行純化和精致純化。通過對比每步鹽析中所采用的（NH4）2SO4的摩爾濃度對純化效果的影響，結合紫外-可見光譜掃描進行組分分析，確定了六步鹽析法中的奇數次鹽析用1.0 mol/L（NH4）2SO4除雜，偶數次鹽析用1.8 mol/L（NH4）2SO4沉淀藻藍蛋白。在六步鹽析法中，純度為0.4的藻藍蛋白經二步鹽析后上升到2.26，經四步鹽析沉淀后純度高達3.48，六步分段鹽析后純度僅上升至3.71，而回收率下降明顯。說明分段鹽析法能夠很好地純化藻藍，且二步鹽析法能夠作為一般純化方法，四步鹽析能夠得到醫藥級藻藍蛋白。此外針對二步鹽析結合雙水相萃取法進行試驗，采用聚乙二醇-硫酸銨雙水相在最優體系下純化，藻藍蛋白純度僅由1.969 升至2.619，且聚乙二醇不易去除，因此該方法不適用于精致純化藻藍。在兩步鹽析結合柱層析試驗中，重點開展接柱層析類型和順序，最終確定先采用Cellufine A-500 初步純化，再進行HA 柱層析2 次純化，可得到醫藥級C-藻藍蛋白和C-別藻藍蛋白。GUO等[25]采用膨脹床偶聯固定床層析方法分離純化藻藍蛋白，將藻藍蛋白粗提液泵入裝有Sereamline DEAE 膨脹柱后洗脫，純度最高可提高8.8 倍，后又采用XAD7HP 固定床對膨脹床富集得到的藻藍蛋白溶液進行層析去除雜蛋白，得到的藻藍蛋白純度提高2.36倍，藻藍蛋白的總回收率最高可達34.96%。

3 穩定性研究

3.1 穩定性影響因素

純化后的藻藍色素易分解，在加工、儲存過程中易受光、熱、pH 值等影響而褪色。CHAIKLAHAN 等[26]在培養基中培養生產螺旋藻，將所得產物抽提、過濾和純化后得食品級藻藍蛋白粉，探究溫度對其穩定性的影響，發現在47 ℃下十分穩定，當溫度更高時藻藍蛋白降解速率急劇增加。程超等[27]以葛仙米藻膽蛋白為原料，研究環境因素對其色度和含量的影響并建立了藻藍蛋白及其色度的降解動力學，表明其熱降解過程符合一級動力學，且發現藻藍蛋白在pH3 時幾乎沒有可見光區的特征吸收峰，pH4 時色素溶液Hunter-b最小，顏色最藍。劉玉環等[28]對極大螺旋藻藻藍蛋白的穩定性進行研究發現，藻藍蛋白在pH5～7，室內可見光或暗光條件下較穩定，常用食品添加劑對藻藍蛋白影響不顯著，Na+、K+、Mg2+對藻藍蛋白影響也不顯著，低濃度的Fe3+、Al3+、Zn2+對其穩定性影響不大，但濃度超過0.002 mol/L 時會使藻藍蛋白產生沉淀，嚴重破壞藻藍蛋白的穩定性。畢海等[29]發現紫外輻照后鈍頂螺旋藻中PC 含量和純度下降，發色團結構發生改變。此外，這些研究中藻藍蛋白的最適條件略有差異，可能與其提取來源不同有關。

3.2 提高穩定性方法

藻藍蛋白作為高營養價值的天然色素，具有廣泛的市場前景，但在加工和儲藏過程中容易受環境影響而褪色，這一弊端大大限制了其應用。目前提高藻藍蛋白穩定性的措施主要包括添加穩定劑及微膠囊技術。

3.2.1 添加穩定劑

楊立紅等[30]從魚腥藻中提取純度為1.958 的藻藍蛋白，探究食品添加劑對其儲存穩定性的影響，試驗表明不同食品添加劑對其影響不同，糖、苯甲酸、赤蘚醇對藻藍蛋白具有保護作用，而乙醇、檸檬酸、山梨酸鉀等對藻藍蛋白色澤有破壞作用。Hadiyanto 等[31]研究葡萄糖、蔗糖及果糖對螺旋藻藻藍蛋白溶液顏色在40、60、80 ℃的保護作用并進行熱降解動力學分析，其中葡萄糖能夠使藻藍蛋白被聚合的活化能提高4 倍，并通過降低IC50值將其抗氧化活性提高18.47%，而在80 ℃條件下，果糖的保護作用最顯著。FAIETA 等[32]研究不同濃度蔗糖和海藻糖對藻藍蛋白熱穩定性的影響，結果表明同濃度下蔗糖比海藻糖的保護效果更顯著，并通過圓二色性證實了藻藍蛋白顏色的損失與蛋白結構不穩定性密切相關。MARTELLI 等[33]進一步研究在高溫條件下向藻藍蛋白溶液中添加蜂蜜或高糖濃度，可有效防止C-藻藍蛋白的藍色降解。數據顯示糖對C-藻藍蛋白藍色的穩定作用與加入的糖的最終濃度有關，而不是與糖的類型有關。呂平平等[34]研究4種化妝品添加劑對藻藍蛋白溶液的影響，發現在0.1 mg/mL 的藻藍蛋白溶液中添加12%甘油、9%丁二醇、3%氯化鈉、0.15%苯甲酸鈉后，在25 ℃避光、25 ℃光照、40 ℃避光的環境中其色素保存率分別提高到78.24%、57.80%、76.02%。此外針對提高藻藍蛋白的酸穩定性，ZHANG 等[35]為解決藻藍蛋白在酸性條件下的聚集問題，加入乳清蛋白、蛋清蛋白及豌豆蛋白，發現乳清蛋白溶液的加入能最有效的防止藻藍蛋白在pH3 的環境中沉淀聚集，這可能是因為乳清蛋白和藻藍蛋白通過靜電或疏水相互作用而使其與環境隔離。FALKEBORG 等[36]研究不同pH 值條件下十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）對藻藍蛋白顏色變化的影響，試驗表明在臨界膠束濃度0.7%的SDS 溶液中，通過阻止藻藍蛋白質子化形式的生成，使藻藍蛋白的藍色構象穩定化。作用機理可能是通過將藻藍蛋白分子包埋在膠束內部，并通過疏水性相互作用使其穩定。

3.2.2 微膠囊包被技術

YAN 等[37]通過擠壓法采用海藻酸鈉和殼聚糖包裹藻藍蛋白，優化工藝為海藻酸鈉（含量2.5%）與藻藍蛋白質量之比為1 ∶1.5、2% 氯化鈣、2%殼聚糖，分別制備藻藍蛋白/海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊及藻藍蛋白/海藻酸鈉微膠囊。進一步分析表明，二者均能提高藻藍蛋白的酸耐受力，相比于藻藍蛋白/海藻酸鈉微膠囊，藻藍蛋白/海藻酸鈉/殼聚糖結構更致密，且能顯著減少藻藍蛋白的熱損失。呂曉玲等[38]選取明膠和麥芽糊精為壁材，采取空氣懸浮包衣法制備藻藍蛋白微膠囊，在溫度80 ℃、霧化壓力0.15 MPa、芯壁材比1 ∶1.5（壁材中明膠20%）的條件下制備藻藍蛋白微膠囊并進行穩定性試驗，表明其光穩定、熱穩定及貯藏穩定性顯著提高。

4 生理活性研究

藻藍蛋白除作為天然色素使用外，也被證實具有抗氧化性、抗癌、抗炎、免疫調節作用等生理活性。

4.1 抗氧化活性研究

劉琪等[39]研究藻藍蛋白對X 射線輻射引起小鼠氧化損傷的保護實驗，發現藻藍蛋白顯著提高輻射后小鼠血漿和肝臟中抗氧化酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低肝組織中活性氧自由基含量，說明藻藍蛋白通過增強機體抗氧化能力來削弱輻射導致的氧化損傷。余佳等[40]對葛仙米中藻膽蛋白粗提物、藻藍蛋白、藻紅蛋白進行體外抗氧化試驗，考察其羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力及脂質過氧化抑制能力，證實3 種蛋白都有很好的抗氧化活性，但三者作用方式不同。汪興平等[41]對葛仙米藻藍蛋白進行非脂質體系抗氧化試驗、體外抗氧化試驗，采用化學發光法證實在一定濃度范圍內，藻藍蛋白對O2-·、·OH 和H2O2的清除能力與濃度呈正相關，IC50值分別為396、185、139 μg/mL，且對小鼠肝線粒體損傷具有保護作用，并能顯著影響血漿的抗活性氧能力。趙艷景等[42]發現紫菜藻藍蛋白也有上述自由基清除能力，其中對O2-·的清除率33.79%，對·OH 清除率為92.71%。為進一步驗證其抗氧化作用機理，陳英杰等[43]研究藻藍色素與牛血清白蛋白之間的結合方式，采用熒光光譜及分光光度法發現藻藍色素濃度與牛血清蛋白的熒光強度成反比，二者相互結合導致的靜態熒光猝滅，反應的結合常數K=1.22×106L/mol，結合位點數n=1.14。

4.2 抗腫瘤活性研究

目前國內外很多文獻證實藻藍蛋白具有體內體外抗腫瘤作用，LI 等[44]通過試驗證明藻藍蛋白能夠抑制A549 細胞的體內生長，抑制人胚肺細胞的增殖，且與全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）協同作用時可降低重組人細胞周期蛋白依賴激酶mRNA水平，上調半胱氨酸蛋白酶-3 表達從而誘導細胞凋亡，當二者聯用時能夠有效減輕ATRA 對人體的毒副作用。SUBHASHINI 等[45]發現50 μmol/L 高純度藻藍蛋白能顯著抑制人慢性粒細胞白血病K562 細胞的生長和增殖，作用48 h 后細胞增殖下降了49%，熒光和電鏡顯示細胞萎縮、核凝聚等凋亡特征，通過流式細胞儀及蛋白質印跡法進一步研究表明藻藍蛋白是通過裂解DNA 修復酶和下調B 淋巴細胞瘤-2 基因來誘導K562 細胞凋亡的。王雪青等[46]對藻藍蛋白抗腫瘤活性的機理進行初探，并研究蛋白質構象變化與其抗癌性質的關系。通過四唑鹽比色法和酶聯免疫吸附實驗測定表明藻藍蛋白及其酶解物可提高半胱氨酸蛋白酶-3 活性，當用100 mg/L PC 處理HeLa 細胞12 h后，Caspase-3 活性迅速增高并達峰值，對HeLa 抑制率達29.9%，而酶解1 h 產物抑制率高達56.5%，但當酶解時間延長至3 h～4 h 時抑制率反而下降，可能是因為適當的酶解使色基基團暴露從而增強抗腫瘤能力，而過度酶解使其活性結構因多肽的失去而發生變化，抑制腫瘤的能力消失。此外多項試驗證實藻藍蛋白能夠抑制肝癌細胞SMMC-7721、喉癌細胞HEp-2[47]、黑色素瘤細胞[48]、肺癌細胞[49]等的生長和增殖。

4.3 抗炎及免疫調節研究

LEDON 等[50]對從微藻中提取出的藻藍蛋白進行抗炎作用探究，通過誘導小鼠水腫，檢測藻藍蛋白存在下前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE 2）濃度和磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA 2）活性的變化。首次證明藻藍蛋白的抗炎作用一部分是因對PGE 2 的產生和對PLA 2 活性的中度抑制所致。HAO 等[51]采用SiLAD動態蛋白質組技術分析藻藍蛋白對脂多糖誘導的RAW264.7 巨噬細胞的影響，揭示了藻藍蛋白是通過下調PDCD5-NF-kB 信號誘導細胞凋亡從而減輕炎癥反應。唐玫等[52]培養富硒藻藍蛋白探究其生理活性，在體外實驗中可提高淋巴細胞轉化率，在小鼠實驗中發現可增強空斑溶血細胞的溶血能力，說明富硒藻藍蛋白能夠提高機體的細胞免疫和體液免疫功能。ZHAO 等[53]建立D-半乳糖導致的衰老小鼠模型，采用不同劑量藻藍蛋白處理小鼠并與對照組比較，測其血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、胸腺指數和脾臟指數，發現條斑紫菜藻藍蛋白能夠顯著提高衰老模型小鼠的胸腺指數、脾臟指數從而提高衰老小鼠免疫功能，通過提高血清中的超氧化物歧化酶活性，顯著降低血清中的丙二醛含量，清除小鼠自由基來延緩衰老，初步推斷其具有較強的抗衰老作用。

通過學者們的研究，藻藍蛋白越來越多的醫用價值被挖掘，目前從藻藍蛋白中提取功能性肽是一大研究熱點，已有不少試驗從螺旋藻及藻藍蛋白中提取出活性肽并掌握其氨基酸序列。劉立闖等[54]采用胃蛋白酶、胰蛋白酶對PC 進行酶解，找尋酶解物對血管緊張素轉化酶是否有抑制作用。結果表明胰蛋白酶在42 ℃、酶與底物質量比1：50、pH8、底物質量分數6%、水解產物的血管緊張素轉化酶抑制率為93.54%。MINIC 等[55]通過分離鑒定胃蛋白酶消化后的藻藍色基活性肽并進行生理活性的測定，表明所得5 種多肽組分均具備顯著的抗氧化和金屬螯合活性。曾巧輝[56]制備螺旋藻蛋白源生物肽，探究其抗皮膚光老化的機理。從抗氧化及抗光老化活性較強的組分中鑒定出6 條多肽，且其中多肽一號（序列為GMCCSR）保護人紅細胞效果最佳，能顯著促進老化的皮膚層纖維細胞增殖和膠原蛋白的產生。除藻藍蛋白及酶解物的功能活性研究外，王雪青等[57]對藻藍蛋白及水解物對玉米直鏈-支鏈淀粉老化的影響，并通過X-射線衍射、差示掃描量熱、紅外等進行機理研究發現：添加10%PC 使直鏈、支鏈淀粉回生率分別提高了60.4%、69.6%；水解肽在同樣劑量下分別提高了184.7%、47.0%。這一研究開辟了功能蛋白干預淀粉回生的新領域，為開發多功能保健食品、拓寬藻藍蛋白和玉米淀粉應用領域找到一條新途徑。

5 結語

藻藍蛋白作為一種稀有的天然藍色素，在食品、藥品、化妝品等領域具有重要的應用價值。藻藍蛋白色澤獨特、營養豐富，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種生理功能，開發應用前景廣闊。但從目前開發來看，藻藍蛋白純化技術還有待于提高，其穩定性問題也一直沒有得到很好的解決，嚴重制約了該色素的廣泛應用，因此，藻藍蛋白的制備以及穩定化技術還需要深入的研究與探索。