液相色譜-串聯質譜法測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量

王孝鋼 范津琿 江志訓 劉彩飛

摘??? 要：為解決有機磷農藥殘留量檢測分析過程中基質效應影響檢測結果的問題，本研究以電噴霧（ESI）為離子源，正離子模式多級反應離子檢測（MRM）方式，建立了一種靈敏度高、選擇性強的基質校正液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），以同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量。以洋蔥為試材，優化選擇了乙酸/乙腈（1：100Vol）+6 g氯化鈉為最佳提取體系，并確定超聲提取30 min、快速混勻器振蕩1.5 min為最佳提取條件。利用該方法檢測洋蔥28種有機磷農藥含量，在0.200～100 μg·L-1質量濃度范圍內其與峰面積之間呈線性關系，相關系數為0.998 27～0.999 90;方法檢出限0.06～0.89 μg·kg-1，定量限0.24～3.6 μg·kg-1;28種有機磷農藥殘留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13個濃度水平的平均回收率為76.4%～102.6%，相對標準偏差為1.1%～9.0%。利用該方法檢測蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量在10 μg·kg-1濃度水平的平均回收率為74.7%～109.9%，相對標準偏差為0.61%～6.2%。綜合而言，所建立的新方法能滿足實際樣品分析檢測的要求。

關鍵詞：液相色譜-串聯質譜法;有機磷農藥;洋蔥;蔥;姜;蒜;韭菜

中圖分類號：0657.63;S481.8???????? 文獻標識碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.012

Determination of 28 Organophosphorus Pesticide Residues in Onion， Scallion， Ginger， Garlic and Leek by LC/MS/MS

WANG Xiaogang1， FAN Jinhui1， Jiang Zhixun1， LIU Caifei2

（1. Qingdao Academy of Agricultural Sciences， Qingdao， Shandong 266109， China; 2. Agricultural and Rural Bureau of Jimo District， Qingdao， Shandong 266200， China）

Abstract： In order to solve the matrix effect in the detection process， the experiment developed a highly sensitive， selective， and matrix corrected LC-MS/MS method by electrospray ionization （ESI） as ion source and MRM in positive ion mode， which could simultaneously determine 28 organophosphorus pesticide residues of onion， scallion， ginger， garlic and leek. Using onion as material， the conditions of HPLC and MS for determination of 28 organophosphorus pesticides were optimized， the optimal extraction system were acetic acid /acetonitrile （1：100Vol） +6 g NaCl， and the optimal extraction process were 30 min of ultrasonic extraction and 1.5 min rapid mixer oscillation. The above method were used to detect? the 28 organophosphorus pesticides in onion， there was a good linear relationship between the organophosphorus pesticides content and peak area in the range of 0.200-100 μg·L-1， and the correlation coefficients were 0.998 27-0.999 90; the detection and quantitation limit were in the range of 0.06-0.89 μg·kg-1 and 0.24-3.6 g·kg-1， respectively; the recovery rate of 28 organophosphorus pesticides residues for 10， 50， 200 μg·kg-1 levels ranged from 76.4% to 102.6%， which the relative standard deviation were ranged from1.1% to 9.0%. The above method were used to detect the 28 organophosphorus pesticides residues in scallion， ginger， garlic， and leek， the recovery rate for 10 μg·kg-1 level were ranged from 74.7% to 109.9% ， which the relative standard deviation were ranged from 0.61% to 6.2%. Comprehensively， the new method could meet the requirements of actual sample analysis.

Key words： LC-MS/MS; organophosphorus pesticide residues; onion; scallion; ginger; garlic; leek

有機磷農藥是一類廣泛用于防治植物病蟲害的高效廣譜殺蟲劑，同時對人畜也有較高的毒害性。在日常農產品檢測中，常常在蔬菜、水果中能檢測出有機磷農藥殘留。洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜等是一類具特殊香辛的鱗莖類蔬菜，該類蔬菜基質中含有大量的含硫化合物，對準確測定有機磷農藥殘留量的影響很大，易出現假陽性和假陰性，是農藥殘留檢測公認的測定難題[1]。因此，研究洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中多種有機磷殘留檢測技術具有十分重要的意義。

測定鱗莖類蔬菜中有機磷農藥的分析方法主要有氣相色譜法[2-4]、氣相色譜-質譜聯用法[1-2，5]、液相色譜-串聯質譜法[7-8]和超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法[9]。由于有機磷農藥種類很多，不同有機磷農藥的性質差別很大，一些有機磷農藥如氧樂果、磷胺和辛硫磷等由于極性和熱不穩定性問題，用氣相色譜法和氣相色譜質譜法無法測定或者靈敏度很低。液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法通過采用多級反應離子檢測（MRM），不但測定的靈敏度高，抗干擾能力強，而且能夠同時定性和定量，是測定有機磷農藥較理想的方法。但用HPLC-MS/MS分析復雜基體時，樣品中共流出物質產生基質效應能夠抑制或增強待測物質的響應值，從而影響待測物質濃度的測定。蘇建峰等[6]用乙腈渦旋提取，提取液經Carb、C18和PSA 粉末分散固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定蔥、姜、蒜與辣椒醬中66種有機磷農藥殘留，方法的回收率在52%～117%之間，其中5%的農藥回收率在50～70%之間。有關同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量的研究較少，前期試驗也驗證了用氣相色譜-火焰光度檢測器測定，基質干擾很大[1，6]，特別是大蒜基質，即使選擇性好的火焰光度檢測器，色譜出峰前20 min 以內仍出現很強的平頭峰，難以準確定量。為解決基質效應問題，本研究詳細探討了影響測定有機磷農藥提取效率的主要因素，并采用基質校正外標法定量，建立了同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量的液相色譜串聯質譜分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent Technologies 6460? Triple Quad LC/MS 液相色譜/三重四極串聯質譜聯用儀（安捷倫公司）， 配有1200 Series G1312 B 二元泵，G1322A 脫氣機、G13670D 自動進樣器、G1316B柱溫箱。儀器操作系統為Mass Hunter軟件。碰撞氣為氮氣（純度99.999% ）。B 5500S-MTH超聲波清洗器（必能信超聲（上海）有限公司）。TDL-5-A臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠）。ZORBAX Eclipse? XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm ）液相色譜柱 。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，Fisher 公司）。甲酸99%（色譜純，ROE Scientific INC.）;乙酸99.5%（天津博迪化工股份有限公司）;氯化鈉（分析純）：140 ℃烘4 h。屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。Nylon with Polypropylene Prefilters針式過濾頭濾膜0.22 μm，13 mm（Agela Technologies）。

1.2 標準樣品的配制

噻唑磷（fosthiazate）（純度93.0%）為固體物質，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，準確稱取適量標準物質溶解于甲醇中配成濃度為1 150 mg·L-1的標準貯備溶液;甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧樂果（omethoate）、久效磷（monocrotophos）、

樂果（dimethoate）、敵百蟲（trichlorfon）、硫環磷（phosfolan）、磷胺（phosphamidon）、敵敵畏（DDV）、殺撲磷（methidathion）、亞胺硫磷（phosmet）、內吸磷（demeton）、馬拉硫磷（malathion）、三唑磷（triazophos）、滅線磷（ethoprophos）、稻豐散（phenthoate）、喹硫磷（quinalphos）、治螟磷（sulfotep）、倍硫磷（fenthion）、蠅毒磷（coumaphos）、地蟲磷（fonofos）、二嗪磷（diazinon）、辛硫磷（phoxim）、伏殺硫磷（phosalone）、丙溴磷（profenofos）、特丁硫磷（terbufos）、毒死蜱（chlorpyrifos）均購于國家標準物質研究中心，此27種物質為液體標準溶液（100～1 000 mg·L-1），上述標準配制后均貯存在-20 ℃冰箱中。使用時，先將貯備液用丙酮稀釋成100 mg·L-1和10 mg·L-1，再用甲醇稀釋成1 mg·L-1的中間工作溶液（內含0.4%的甲酸），最后用乙腈+水（2+3）稀釋成一定濃度的工作溶液。

1.3 試驗所用樣品的準備及處理

1.3.1 試驗所用樣品的準備 試驗所用樣品均來自青島本地農產品例行檢測過程中未檢出此28種農藥殘留檢測結果（含量低于所用方法的本實驗室檢出限）的樣品，檢測所用方法執行農業部農產品質量安全例行檢測工作要求，其中噻唑磷、內吸磷、稻豐散和喹硫磷參照GB/T20769-2008方法進行檢測，其它24個參數用NY/T761-2008方法檢測。樣品勻漿后各約1 kg，每種樣品各分為10份，每份約100～150 g，于200 mL的帶蓋樣品盒中冷凍保存，其中4份為例行檢測過程中同類樣品的空白試驗備用，另外6份根據試驗進度分別作為本實驗中提取體系的選擇、提取效率影響因素的分析、溶劑置換對回收率的影響、線性方程和方法有效性評價等過程中的樣品或基質使用，以減少基質效應對測定的影響。在本試驗開始前，4份空白試驗備用樣品在使用過程中未發現對空白試驗有顯著影響，因此所選用的試驗樣品能滿足本試驗的要求（空白試驗結果見表1）。

1.3.2 試驗所用樣品的處理 稱取勻漿樣品10.00 g放入帶蓋子的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25.0 mL，擰緊蓋子，在超聲波清洗器上超聲提取30 min，提取液過濾后，往濾液中加入6 g氯化鈉，擰緊蓋子，混勻，在快速混勻器上混勻1.5 min，最后將含有樣品的聚四氟乙烯離心管放入臺式離心機中以5 000 r·min-1的轉速離心5 min。離心后，分取上層乙腈提取液1.00 mL于干凈的小燒杯中，加入1.50 mL蒸餾水混勻，以0.22 μm針式過濾頭濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 液相色譜條件

選用ZORBAX Eclipse? XDB C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）為分析柱。流動相組成：含2.5 mmol·L-1甲酸銨的水（A）和含2.5 mmol·L-1甲酸銨的甲醇（B）。以梯度洗脫，分別為0 min：90/10（A/B）;2 min：85/15;4 min：60/40;10 min：40/60;15 min：25/75;23 min：15/85;25 min：5/95（1.00min）;27： 90/10（A/B），27～36 min： 90/10（A/B）。流速為0.40 mL· min-1，進樣5 μL，柱溫40 ℃。

1.5 質譜條件

離子源為電噴霧（ESI），采用正離子模式采集數據。掃描方式為反應離子監測（MRM），干燥氣溫度：300 ℃;干燥氣流速：8 L·min-1;霧化器壓力：25 psi;鞘氣溫度：330 ℃;鞘氣流速：9 L·min-1。電子倍增器電壓增量值：400 V; 噴嘴電壓為0 V。MRM離子對、裂解電壓、碰撞能量、毛細管電壓等參數見表2。根據28種有機磷農藥的保留時間分8個時間段采集，見表3。

2 結果與分析

2.1 提取體系的選擇

測定蔬菜和水果中農藥殘留最常用提取劑為乙腈。AOAC QuEChERS方法是用乙腈提取，并以乙酸鹽緩沖液促進分配。本文以洋蔥（10 g）為基質，按照1.3.2的步驟，分別采用表3中的不同提取體系進行提取。樣品提取后分取1 mL乙腈提取液，自然揮干，加入1 mL甲醇和1.5 mL蒸餾水混勻，測定28種有機磷的回收率。結果（圖1）表明，敵敵畏（化合物9）在8種提取體系中回收率小于38%，在含有無水硫酸鈉體系中回收率小于10%;滅線磷（化合物16）在提取體系F和G中回收率小于50%;治螟磷（化合物19）、地蟲磷（化合物22）和特丁硫磷（化合物27）在體系E、F和G中回收率介于17%～46%之間;亞胺硫磷（化合物12）在體系F中回收率高達170%;其它22種有機磷在8種體系中的回收率介于50%～118%之間。綜合考慮，提取體系B即用乙酸/乙腈（1：100 Vol）溶液提取，提取效果最好，所以選擇此體系。

2.2 其他影響樣品提取效率因素的研究

對影響樣品提取效率的其他因素如冰乙酸的量、乙腈的體積，快速混勻器上混勻的時間，震蕩提取和超聲提取時間進行了優化，這幾個因素優化后的最佳量化值為乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25 mL，超聲30 min后，快速混勻器上混勻振蕩1.5 min。綜合本節與2.1的結果，以洋蔥10 g為基質，按1.3.2步驟進行測定，28種有機磷的回收率均在70%～120%范圍內。

2.3 溶劑轉換對28種有機磷農藥回收率的影響

一般在進行HPLC-MS/MS分析樣品時，通常樣品提取后，需要將溶劑轉換成與流動相相同的溶劑，以取得最佳的色譜峰型。試驗表明，盡管用甲醇+水（2+3）做溶劑，有機磷農藥的色譜峰最佳，但將提取體系的溶劑由乙腈轉換成甲醇后，敵敵畏、治螟磷、特丁硫磷、地蟲磷、滅線磷和二嗪磷6種農藥的損失很大，回收率在15.8%～61.5%之間，特別是敵敵畏、治螟磷的回收率不足20%。但如果溶劑為純乙腈，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果的總離子流峰會出現雙頭峰，為改善3種農藥的色譜峰型，本文比較了用不同比例的乙腈水做溶劑對色譜峰型的影響。結果表明，乙腈水的比例為2+3時，色譜的峰型較好，盡管他們的色譜峰沒有甲醇+水（2+3）做溶劑的好，但6種農藥的回收率有較大的提高。故本文最終選擇乙腈水（2+3）做溶劑。

2.4 線性范圍、線性方程及相關系數

28種有機磷農藥在不同的基質中，表現出的基質效應也不一樣，為了減少基質效應對測定的影響，本研究采用基質標準曲線作為定量曲線。在儀器的最佳測定條件下，洋蔥基質中28種有機磷農藥的線性回歸方程見表4，在0.200～100 μg·L-1的濃度范圍內，權重采用（1/X），有機磷農藥的含量與峰面積之間的相關系數在0.998 27～0.999 90范圍內。

2.5 方法有效性的評價

分別稱取10.00 g未檢出28種有機磷農藥殘留的洋蔥樣品，28種有機磷農藥的加標濃度為10.0，50.0，200 μg·kg-13個水平，測定結果見表5，標準物質的MRM質譜圖和洋蔥加標樣品的MRM質譜圖見圖2。由表5可知， 28種有機磷6次測定的平均回收率在76.4%～102.6%，相對標準偏差在1.3%～8.1%之間，試驗結果表明回收率符合農藥殘留檢測實際要求。

向7個洋蔥樣品中分別添加濃度為3 μg·kg-1的28種有機磷農藥，按照所建立方法的樣品全部分析步驟進行測定，計算方法檢出限（MDL）=S×3.143，式中的S為7次測定值的標準偏差。28種有機磷農藥殘留的檢出限在0.06～0.89 μg·kg-1 范圍內，定量限在0.24～3.6 μg·kg-1。根據GB2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》的規定，鱗莖等類蔬菜中28種有機磷農藥有規定的最大殘留限量值均在0.01 mg·kg-1及以上（表1），因此，所建立的分析方法完全能夠滿足28種有機磷農藥痕量殘留量分析的要求。

分別稱取蔥、蒜、韭菜及姜各8份樣品，2份樣品作為空白，6份樣品加入濃度水平為10.0 μg·kg-1的28種有機磷農藥，利用所建立方法的提取、檢測步驟測定相關農藥的量。結果（表6）表明，蔥、蒜、韭菜及姜4種基質中28種有機磷農藥的平均回收率均在74.7%～109.9%，相對標準偏差在0.54%～6.3%之間;其中，作為基質的姜樣品中檢出了噻唑磷，2份空白樣品測定的平均含量為12.1 μg·kg-1，6份加標樣品測定的結果在扣除空白樣品的測定值后，平均回收率為101.7%，6份加標樣品測定結果的RSD 為1.8%，結果完全符合GB2763-2019的相關要求，這從側面證實了本方法的有效性和準確性，而且檢出限更低。

3 結 論

本研究以乙酸/乙腈（1：100 Vol）+6 g氯化鈉為提取體系，用基質校正液相色譜三重四級串聯質譜建立了同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量的測定方法。試驗結果表明：28種有機磷農藥在0.200～100 μg·kg-1質量濃度范圍內成線性關系，相關系數在0.998 27～0.999 90;方法檢出限在0.06～0.89 μg·kg-1之間，方法定量限在0.24～3.6 μg·kg-1 范圍內。洋蔥中28種有機磷農藥殘留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13個濃度水平的平均回收率在76.4%～102.6%之間，相對標準偏差在1.1%～9.0%之間;蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農藥殘留量在10 μg·kg-1濃度水平的平均回收率在74.7%～109.9%之間，相對標準偏差在0.61%～6.2%之間。上述方法解決了基質干擾問題和一些有機磷農藥回收率低的問題，方法準確度高，靈敏度好，簡單、快速。

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