引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

張莞苓，薛雅蓉，郭雨，左廣勝，劉常宏

（1.南京大學生命科學學院，江蘇南京 210023；2.北京中龍創科技有限公司，北京 100071）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科姜屬多年生草本植物，也是重要的藥食兩用經濟類蔬菜作物，在亞洲、非洲、南美洲等地區都有栽培。我國是生姜主產國之一［1］，主產區在山東、河南、四川等省［2］，是種植區農業經濟的支柱作物，且具有很高的出口創匯價值。生姜塊莖腐爛等病害的連年發生嚴重影響了生姜的產量和品質，造成巨大的經濟損失［2-4］。分離并鑒定引起生姜塊莖腐爛的病原菌并有針對性的防治，是控制該病發生的根本方法。

已報道的引起生姜塊莖腐爛的病原菌主要有青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）［5］、歐文氏菌（Erwinia spp.）［6］、短 小芽 孢桿 菌 （Bacillus pumilus）［7］、群 結 腐 霉 菌 （Pythium myriotylum）［8，9］和 尖 孢 鐮 刀 菌 （Fusarium oxysporum）［10，11］。由于地理環境及氣候差異，這些病原菌在各地的分布不盡相同，并且還可能存在尚未發現的新病原菌。

山東為我國生姜種植面積最大的省份，2019年種植面積10.15萬公頃，占北方生姜種植總面積（11.39萬公頃）近90%，超過全國生姜種植總面積（28.43萬公頃）的 1／3［12］，在我國生姜種植產業和生姜產品供應體系中有著舉足輕重的地位和作用。為了解引起山東省濰坊市生姜種植區生姜塊莖腐爛的原因，本試驗從濰坊市多地生姜種植田采集腐爛塊莖，進行病原菌的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐爛生姜塊莖：于2017年8月（生姜大培土期）采自山東省濰坊市青州朱家埠村（QZ）、安丘凌河鎮馬家河崖頭村（AQ）、昌邑北孟鎮上坡村（CY）、昌樂紅河鎮王家埠村（CL）生姜栽培區發病地塊（發病率超過60%），生姜莖葉嚴重失綠黃化、根莖腐爛。

細菌分離培養基：LB瓊脂培養基。

真菌分離培養基：含0.5 mg／mL的硫酸鏈霉素和氯霉素的PDA培養基。

1.2 病原菌的分離

清洗發病生姜；75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次；3%的次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗3次；滅菌濾紙吸干表面水分。用無菌刀片將病健交界處組織切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.1 cm大小，分別放于固體 LB（37℃，24 h）和 PDA（28℃，5 d）培養基上培養，待菌落長出后進行純化，并對純培養物進行常規保種。

1.3 病原菌的鑒定

根據菌落及菌絲形態觀察，結合基于細菌16SrDNA（引物：27F／1492R）和真菌 ITS（引物：ITS1／ITS4）的特異性 PCR擴增產物的測序結果［8］，確定引起生姜塊莖腐爛的病原菌分類地位。

1.4 接種體的制備

細菌菌懸液的制備：挑取純化細菌單菌落，接種至LB液體培養基，37℃、150 r／min培養24 h；4 000 r／min離心5 min收集細菌，用PBS緩沖液重懸并調菌懸液濃度至3×108cfu／mL，用于致病性接種試驗。

真菌菌餅的制備：挑取少量菌絲于PDA平板上，置于28℃恒溫箱黑暗培養5 d，沿菌落邊緣用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅。

真菌孢子懸液的制備：參照黃福新等［13］的方法。將真菌接種在PDA培養基上，25℃黑暗培養10 d；在超凈工作臺內將菌絲刮入無菌水中，攪拌后用無菌紗布過濾除去菌絲；濾液用無菌水調孢子懸液濃度為1×105個／mL。

1.5 致病性試驗

按照1.2的方法消毒健康生姜塊莖表面，然后將其橫切成厚度約1 cm的姜片；向其表面涂布細菌菌懸液（以涂布無菌水為對照）或接種真菌菌餅（以接種PDA固體培養基為對照）；將涂布有細菌和無菌水的姜片置37℃黑暗培養48 h，將接種真菌菌餅和PDA固體培養基的姜塊置30℃封閉保濕培養5 d。肉眼觀察生姜塊莖的腐爛情況，檢測所接種細菌或真菌對生姜塊莖組織的致病性。進一步分離鑒定腐爛塊莖組織中的病原菌，檢查其與原接種菌的一致性。

1.6 盆栽試驗

按照1∶10（V／W）的比例，將病原細菌菌懸液或病原真菌孢子懸液混入滅菌營養土中，同時設置接種等體積的無菌水為對照，攪拌均勻后裝入花盆中，播種1塊健康生姜塊莖，每處理共5盆，于光照培養箱中培養，觀察生姜生長及發病情況。56 d后刨出生姜塊莖，用無菌水沖洗干凈，觀察生姜塊莖腐爛情況，并統計生姜植株葉片數、株高、莖圍、莖葉鮮重與塊莖鮮重。

1.7 數據處理與分析

采用Graphpad Prsism 6軟件進行Duncan’s檢驗（P＜0.05）；采用Mega 10構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

根據菌落形態和基因序列分析，從20個腐爛塊莖中共分離獲得10株細菌和3株真菌（表1）。

利用生姜塊莖切片接種技術，評估了分離獲得的細菌和真菌菌株引起健康生姜塊莖腐爛的能力，發現只有2株細菌（E4，E17）和1株真菌（F01）能夠引起健康生姜塊莖組織病變（表1，圖1），分別占總細菌種類的20.0%和總真菌種類的33.3%。從發病組織中能夠重新分離獲得相同的病原菌，因此，E4、E17和F01鑒定為引起生姜塊莖腐爛的病原菌，并且在山東濰坊市的青州（QZ）、安丘（AQ）、昌邑（CY）和昌樂（CL）等地來源的腐爛生姜塊莖中普遍存在（表1）。

E4菌株在LB培養基上的菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，不透明，邊緣整齊，有黏性（圖2A）。顯微鏡觀察顯示，E4菌株呈短桿狀，大小（1.3～1.5）μm ×（0.7～0.9）μm，兩端鈍圓，中生芽孢，無鞭毛和莢膜、革蘭氏陽性（圖2B）。16SrRNA基因序列相似性分析（表1）及系統發育樹（圖3）顯示，E4菌株與短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）親緣關系最近。綜合形態學和基因序列分析，鑒定E4菌株為短小芽孢桿菌。

表1 病姜塊中分離到的病原菌、分布及侵染性

圖1 病原菌（E4、E17、F01）引起生姜塊莖腐爛癥狀

圖2 E4菌株的菌落和菌體形態

圖3 E4菌株的系統發育樹

E17菌株LB培養基上的菌落呈圓形，表面光滑，濕潤有黏性，邊緣整齊，產生可擴散的水溶性綠色色素（圖4A）。菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀，兩端鈍圓（圖4B）。16S rRNA基因序列相似性（表1）和系統發育樹（圖5）分析表明，E17菌株與銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）親緣關系最近。綜合形態學和基因序列分析，鑒定E17菌株為銅綠假單胞桿菌。

圖4 E17菌株的菌落和菌體形態

圖5 E17菌株的系統發育樹

F01菌株在PDA培養基上生長良好，氣生菌絲為白色絮狀或絨毛狀；培養初期，菌落為白色，中間以輻射狀出現淡紫紅色，背面產生深紫紅色色素；菌株氣生菌絲茂盛，菌絲濃密，質地厚實（圖6A）；大型分生孢子呈鐮刀形，兩端漸尖，基細胞足狀，多數3個分隔，少數4～7個分隔，大小為（20.5～56.7）μm ×（3.0～6.3）μm（圖6B）；分生孢子梗呈瓶頸狀，小型分生孢子較多，呈卵形或橢圓形，0～1個分隔，大小為（5.2～16.8）μm ×（2.1～5.0）μm；厚垣孢子間生或頂生，球形或橢圓形，壁光滑（圖6C）。ITS序列相似性分析（表1）和系統發育樹（圖7）表明，F01菌株與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的親緣關系最近。

圖6 F01菌株的菌落特征及孢子形態

2.2 盆栽試驗結果

盆栽試驗結果表明，接種病原菌E4、E17和F01菌株56 d后，生姜長勢極差（圖8A）。刨出生姜塊莖后發現，3種病原菌均可致生姜塊莖100%發生褐變，以接種E17菌株引起的褐變最為嚴重（圖8B）。該結果進一步表明E4、E17和F01菌株均為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

由表2可知，E4、E17和F01菌株侵染后，生姜的葉片數、株高、莖圍、莖葉鮮重和塊莖鮮重均顯著低于對照，但不同病原菌對生姜生長的危害程度差異不顯著（P ＞0.05）。

表2 不同病原菌對生姜生長的影響

圖7 F01菌株的系統發育樹

圖8 不同病原菌對生姜塊莖及植株生長的影響

3 討論與結論

通過對山東省濰坊市多地生姜腐爛塊莖中病原菌的分離、鑒定及致病性評價，共獲得10株細菌3株真菌，其中，2株細菌（短小芽孢桿菌E4和銅綠假單胞桿菌E17）和1株真菌（尖孢鐮刀菌F01）為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

已有報道顯示，短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌為引起萊蕪區生姜塊莖腐爛的病原菌［7，10］。本研究發現，該兩種病原菌在濰坊生姜種植區也普遍存在，表明短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌可能是導致生姜塊莖腐爛的重要病原菌。

銅綠假單胞桿菌在自然界分布廣泛，是土壤常見細菌之一，可引起黃瓜細菌性白枯病［14］和煙草細菌性葉斑病［15］等病害。迄今未見其作為引起生姜塊莖腐爛病原菌的報道。本次從生姜腐爛塊莖內分離到該菌，姜塊組織及盆栽試驗均顯示其能夠引起生姜塊莖腐爛，植株生長受阻，是一種新的生姜塊莖腐爛致病菌。該研究結果對于研發針對銅綠假單胞桿菌的新型殺菌劑或優化原有登記農藥配方和使用技術［16，17］，確保生姜健康栽培有重要的參考價值。

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