生物有機肥對紅富士樹體生長及土壤微生物群落結構的影響

薛曉敏，韓雪平，陳 汝，王來平，王金政

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

化肥一直以來作為農業增產的重要手段，我國化肥消費量達5.56×1010kg，占世界化肥總消費量的34%［1］，我國大部分耕地土壤貧瘠［2］，加上長期施用化肥、除草劑和殺蟲劑及無節制的掠奪式生產模式，破壞了土壤結構，造成土壤營養元素嚴重缺失，土壤酸化，土地生產能力顯著下降［3-4］，基于目前化肥不當使用帶來的危害以及國家對于減少化肥使用的政策驅動，生物有機肥以具有改良土壤肥力、促進作物營養吸收、提高農作物產量及改善品質等獨特的優勢成為化肥的替代品，對農業的發展具有重大意義［5-7］。

海藻肥是以天然海藻為原料，通過物理和生化工藝提取、精制或再混配以氮磷鉀和微量元素制成的生物肥，含有海藻特有的海藻酸鈉、礦物質、氨基酸和植物自然生長調節物質等［8］。很多研究表明，施用海藻肥后可促進植物根系發育和主莖的伸長，提高農作物產量，改善果實品質，增強對干旱環境的抵抗力［9-10］，還具有抗病抑菌作用和防止病蟲害的發生［11］。葡萄籽肥是以天然葡萄籽制成的肥料，含有多酚化合物、氨基酸、礦物質、脂肪等有益于植物生長的物質［12-14］，多用于醫學，可以溫和抑制口腔病原菌微生物，是一種非常有前景的天然抗菌物質［15］。目前，對于生物有機肥的研究主要集中在不同類型功能微生物的篩選、生產工藝和技術以及對農作物產量的影響［16］，而關于生物有機肥對土壤微生物的研究卻少見報道。微生物是土壤中重要的組成部分，它們在改善土壤質量、提高土地生產力和土壤健康可持續發展方面發揮著重要作用［17］，不同的施肥處理很大程度上影響土壤微生物的群落結構與數量［18-19］。因此，對施加生物有機肥后土壤微生物群落結構變化的研究具有重要意義。本研究以7年生煙富3蘋果為試材，對施加45%有機肥、葡萄籽肥和海藻肥以后樹體生物量、產量及果實品質進行了測定，同時，采用高通量測序技術，對土壤微生物群落結構進行研究，為今后生物有機肥在果園生產上的有效應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗園概況

試驗在文登市澤頭鎮峰山村果園進行，該園地處東經121°43′～122°19′，北緯36°52′～ 37°23′，年均降水量762.2 mm，降水分布不均，夏季集中，6～9月份降水量約占全年70 %，春秋季降水偏少，常發生干旱；年平均氣溫11.5℃，極端最高氣溫36.4℃，極端最低氣溫-25.5℃，年日照時數2 540.7 h，無霜期194 d。試驗地土壤類型為棕壤土，建園前為楊樹林，土壤肥力水平較差。

1.2 試驗材料

供試品種為7年生‘煙富3’，砧木為平邑甜茶（Malus hupenensisRehd.），2010年春季定植建園，株行距3.0 m×5.0 m，南北行向，樹形為小冠疏層形，行間自然生草，樹盤起壟栽培，有滴灌系統，管理水平偏上。

1.3 試驗設計

試驗設3個有機肥處理（表1），分別為海藻有機肥11 250 kg/hm2、葡萄籽有機肥4 500 kg/hm2、45%有機肥11 250 kg/hm2（對照CK），其中，海藻有機肥有機質含量≥45%，N+P+K≥5%；葡萄籽有機肥有機質含量≥90%，N+P2O5+K2O≥12%；45%有機肥有機質含量≥45%，有效活菌數≥0.2億/g，N+P+K≥5%。選擇樹勢均勻一致的蘋果樹為樣本樹，10株樹為一小區，3次重復，每處理共計30株樹。2016年10月，在樣本樹四周距樹干30 cm左右挖深度約30 cm的放射溝，將有機肥進行溝施，然后覆土、澆水。生長季除6月份每株樹追施500 g左右果樹專用復合肥（N≥16%，P2O5≥6%，K2O≥32%）外，不再施其他肥料，其它管理按常規進行。

表1 試驗處理

1.4 樣品采集

1.4.1 土壤樣品采集

于果實成熟期進行土壤樣品采集。采用五點取樣法，分別在處理的30株樣本樹東、南、西、北4個方位距樹干60 cm處用直徑4 cm土壤取樣器采集 0～20、20～40 cm土壤，去除雜質后進行混合，裝進封口袋放進干冰中帶回實驗室，-80℃冰箱保存用于微生物多樣性分析。

1.4.2 果實采集

果實成熟后在樣本樹樹冠外圍1.3～1.5 m高度隨機采果50個，運回實驗室測定單果重、縱橫徑、著色指數、光潔度指數、果肉硬度、可溶性固形物含量等品質指標。

1.5 測定項目及方法

1.5.1 高通量測序方法

采用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，之后取3 μL進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度和濃度。之后使用ABI9700 智能梯度PCR儀進行PCR擴增，第一次PCR擴增體系包括：10 μL 5xBuffe，1 μL dNTP（10 mmol/L），1U Phusion 超保真DNA聚合酶，F/R內側引物（10 μmol/L）各1 μL，20 ng模板，ddH2O補至 50 μL；第二次PCR擴增體系包括8 μL 5xBuffe，1 μL dNTP（10mM），0.8 U Phusion 超保真DNA聚合酶，1 μL F/R 外側引物（10 μmol/L），5 μL模板，ddH2O補至 40 μL。引物對應區域：16S V4-V5 區引物（515F和926R），鑒定細菌多樣性；ITS1區引物（ITS1F和ITS1R），鑒定真菌多樣性。

采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，采用FTC-3000TMreal- time PCR儀對凝膠回收產物進行定量，使用Tru Seq? DNAPCR-Free Sample Preparation Kit 建 庫 試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫用 FTC-3000TM real-time PCR 儀進行實時熒光定量，文庫合格后，使用Hi Seq2500 PE250進行上機測序。

1.5.2 樹體結構及枝類組成的調查測定

于落葉后用卷尺及游標卡尺測量樹高、干徑、冠徑、外圍新梢長度，并統計葉叢枝、短枝、中枝、長枝、徒長枝數量，計算枝類比例。

1.5.3 產量調查

果實成熟后單株數果，單位枝采果、稱重，計算平均單果重和折合每公頃產量。

1.5.4 果實品質的測定

單果重用 1/100 電子天平稱量，果實縱、橫徑用數顯游標卡尺測量，果實去皮硬度用GY-1 型果實硬度計測量，可溶性固形物含量用數顯糖量計測定，果面色澤用日本產CI-410色差計 測定。

果面著色指數=∑（各級果數×代表級值）/（總果數×最高級值）×100%

光潔度指數=∑（各級果數×代表級值）/（總果數×最高級值）×100%

分級標準如表2所示。

表2 果實著色和光潔度分級標準 （%）

1.6 數據分析

測序數據采用雙端fastq 格式保存（fq1和fq2），并根據 Barcode 信息對原始序列進行拆分，確定各樣本對應的有效序列數。用Trimmomatic軟件對有效序列進行質量過濾，用FLASH軟件對每個樣品的reads進行拼接［20］；再使用Mothur 1.33.3軟件去除（screen），得到優化序列（clean Tags）［21］。利用Uparse在97%相似度下進行優化序列聚類，得到OTU的代表序列，再用Uchime去除嵌合體［22］，其中16S嵌合體數據庫為gold database（v20110519），ITS嵌合體數據庫為UNITE（v20140703）；然后用usearch_global篩選OTV的代表序列，通過Mothur（classify.seqs）軟件將OTU代表序列與數據庫比對進行物種注釋，置信度閾值為0.8。

使用Mothur軟件分析Alpha多樣性［23］，包括Chao1、Ace及Simpson指數；使用R軟件繪制稀釋曲線、聚類圖等，使用Excel 2010和SPSS 23.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 施用不同肥料對紅富士樹體生長的影響

由表3可以看出，與45%有機肥處理（CK）相比，經過葡萄籽肥G和海藻肥F處理后紅富士的株高和地徑均有所提高，差異表現不顯著；冠徑在東西方向表現為F>G>CK，差異顯著，而南北方向則相反，其中 CK與F之間差異顯著；外圍新梢表現為葡萄籽肥G顯著高于海藻肥F和CK；枝類比例中海藻肥處理葉叢和短枝比例最高，占總枝量的59.53%，而長枝和徒長枝比例最低，為33.23%，其次是葡萄籽肥，分別為54.42%和37.22%，而CK比例最低，分別為53.80%和37.62%。

表3 生物有機肥對紅富士樹體生長發育的影響

2.2 施用不同肥料對紅富士產量的影響

由表4可以看出，與有機肥處理（CK）相比，經過葡萄籽肥G處理后紅富士的平均單株果數、平均單果質量、單株產量和每公頃產量均顯著增加，分別增加了13.55%、4.31%、18.44%和18.44%；經過海藻肥F處理后紅富士的平均單果質量、單株產量和每公頃產量均顯著增加，分別增加了5.18%、1.11%和1.11%；

表4 生物有機肥對紅富士產量的影響

2.3 施用不同肥料對紅富士果實品質的影響

果實品質測定結果（表5）顯示，紅富士著色指數和光潔度指數均表現為海藻肥F>葡萄籽肥G>有機肥（CK），表現出顯著性差異；果形指數以及可溶性固形物含量在處理間均無明顯差異；色澤 L、a和b均表現為海藻肥F最大，其中色澤L葡萄籽肥G與CK差異不顯著；陽面硬度均高于陰面硬度，但在處理間差異均不顯著，綜合而言，生物有機肥處理對果實外觀及內在品質優于CK，其中，海藻肥處理果實品質最好，果實著色面積最大（著色指數88.89%），顏色最紅（a 值39.33），果面光潔度最高（光潔度指數85.48%、L值49.80），果肉陽面硬度最高（9.18 kg/cm2），可溶性固形物含量較高。

表5 生物有機肥對紅富士果實品質的影響

2.4 樣品測序結果評估

通過數據統計軟件處理各階段樣品序列數，評估數據質量。各樣品測序數據評估結果如表6 所示。

稀釋性曲線可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度［24］，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，由圖1可以看出，在一定范圍內，隨著測序數的增多，若曲線表現為急劇上升，則表示群落中有大量物種被發現；當曲線趨于平緩時，則表示此環境中的物種并不會隨著測序數量的增加而明顯增多［25］。樣品稀釋曲線分別在測序數為 20 000 條處逐漸趨向平坦，而表6顯示，細菌的優化測序數量超過25 000條，真菌的優化序列超過40 000條，說明樣品序列充分，測序數量合理。

表6 土壤樣本細菌和真菌測序結果統計

圖1 土壤樣本細菌和真菌稀釋曲線

2.5 施用不同肥料對土壤微生物群落組成的影響

從圖2可以看出，不同生物有機肥處理細菌和真菌門水平相對豐度和群落組成發生一定改變，土壤中的優勢細菌群落包括酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），非優勢細菌包括衣原體門（Gracilibacteria、Chlamydiae）、梭桿菌門（Omitrophica、Fusobacteria）等（圖2左），同時0～20和20～40 cm土層優勢群落的相對豐度會發生調整。與有機肥處理（CK）相比，海藻肥F處理后0～20和20～40 cm土層酸桿菌門的相對豐度均有所提高，較對照分別提高了13.18%和191.42%；降低了變形菌門和擬桿菌門的相對豐度，較對照分別降低了14.39%、13.27%和64.39%、29.67%；降低了0～20 cm土層芽單胞菌門的相對豐度，提高了20～40 cm土層芽單胞菌門的相對豐度。葡萄籽肥處理后0～20和20～40 cm土層酸桿菌門的相對豐度均有所降低，較對照分別降低了43.52%和16.67%；提高了0～20 cm土層變形菌門的相對豐度，降低了20～40 cm土層變形菌門的相對豐度；降低了0～20 cm土層芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度，較對照分別降低了18.15%和10.49%，提高了20～40 cm土層芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度。值得注意的是，海藻肥處理后20～40 cm的第一大優勢門是酸桿菌門，其他處理的第一大優勢菌門是變形菌門。子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）是土壤中含量最豐富的兩大真菌群落（圖2右），對0～20 cm土層來說，海藻肥和葡萄籽肥處理均提高了子囊菌門的相對豐度，其相對豐度表現為G_1>F_1>E_1，降低了接合菌門的相對豐度，其相對豐度表現為E_1>F_1>G_1；對20～40 cm土層來說，海藻肥和葡萄籽肥處理均提高了接合菌門的相對豐度，其相對豐度表現G_1>F_1>E_1，其中海藻肥處理提高了子囊菌門的相對豐度，較對照提高了56.88%，葡萄籽肥處理降低了子囊菌門的相對豐度，較對照降低了47.04%。不同生物有機肥處理均不同程度上改變了不同土層細菌和真菌的群落組成。

圖2 門分類水平土壤樣本細菌和真菌群落組成

2.6 施用不同肥料對土壤微生物Alpha多樣性的 影響

Alpha多 樣 性（Alpha diversity）包 括Chao1指數、Ace指數、Shannon指數以及Simpson指數等。前面3個指數越大，最后1個指數越小，說明樣品中的物種越豐富［26-27］。由表7可以看出，對于0～20 cm土層，海藻肥和葡萄籽肥處理后土壤細菌Ace指數和Chao1指數變化較小；海藻肥處理后降低了土壤細菌Simpson優勢度指數，提高了土壤細菌Shannon 指數，葡萄籽肥處理正好與此相反，3種生物有機肥處理土壤細菌Simpson優勢度指數以G最高，達到0.055 3。海藻肥和葡萄籽肥處理均提高了土壤真菌Ace、Chao1豐富度指數和Simpson優勢度指數，顯著降低Shannon指數。對于20～40 cm土層，海藻肥處理后降低了土壤細菌和真菌Ace、Chao1豐富度指數和Shannon指數，顯著提高Simpson優勢度指數；葡萄籽肥處理則提高了土壤細菌和真菌Ace、Chao1豐富度指數和Shannon指數，顯著降低了Simpson 優勢度指數。由此可見，不同生物有機肥處理后在不同程度上改變了土壤細菌和真菌的群落多樣性，海藻肥和葡萄籽肥處理后表層土壤細菌多樣性增加，真菌多樣性降低。

表7 樹盤覆蓋對土壤微生物Alpha多樣性的影響

2.7 土壤物種豐度聚類熱圖

Heatmap 是以顏色梯度來代表數據矩陣中數值的大小并根據物種或樣品豐度相似性進行聚類的1種圖形展示方式。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品群落組成的相似性和差異性?？v向聚類表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，2 個物種間距離越近，枝長越短，說明這2個物種在各樣品間的豐度越相似；橫向聚類表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣［16］。對土壤中相對豐度前50的細菌和真菌屬進行聚類分析（圖3）得知，葡萄籽肥處理后0～20和20～40 cm土層細菌和真菌群落均聚為1個分支，表明其組內差異較小，E_1、F_1、G_1、G_2和 E_2樣品最終聚為一大類，最后與F_2的樣品聚為一類，表明E_1、F_1、G_1、G_2和 E_2的組間差異相對較小，而與F_2在屬水平的物種組成上有一定差異。在屬水平上的真菌多樣性豐度圖（圖4左）顯示，海藻肥和葡萄籽肥處理后0～20和20～40 cm土層真菌優勢屬的豐度與有機肥處理（CK）差異較小，Geratobasidlum優勢屬的豐度在土壤真菌群落中顯著降低，其中F_2處理Clonostachys（螺旋聚孢霉屬）、Lecanicillium（蚧霉屬）、Exophiala（外瓶霉屬）、Mrakia（木拉克酵母屬）、Gliomastix（粘鞭霉屬）、Coprinus（鬼傘屬）等14個優勢屬在土壤真菌群落中顯著降低；在屬水平上的細菌多樣性豐度圖（圖4右）顯示，葡萄籽肥處理后G_1（0～20 cm）和G_2（20～40 cm）優勢屬的豐度差異較小，海藻肥處理后F_1（0～20 cm）和F_2（20～40 cm）優勢屬的豐度差異顯著，F_1（0～20 cm）和CK的E_2（20～40 cm）優勢屬的豐度差異 較小。

圖3 不同生物有機肥處理在屬水平上的細菌和真菌群落結構聚類圖

圖4 屬水平土壤樣品細菌和真菌豐度聚類熱圖

3 討論

3.1 生物有機肥對紅富士樹體生物量的分析

中國雖是世界第一大蘋果生產國，但并不是蘋果生產強國［28］。由于過度追求蘋果大小和產量，長期化肥單施和過量施用導致土壤板結、酸化、鹽漬化，果樹根系生長環境惡化，使得蘋果產量和品質下降［29］。宋以玲等［30］研究發現用不同比例和種類的生物有機肥代替化學氮肥的投入在一定程度上可以提高作物產量及品質，這與本試驗研究結果一致，3種有機肥處理均在不同程度上提高了紅富士樹體的生長。有研究發現，生物有機肥是采用完全腐熟的加工工藝，蟲卵死亡率能夠達到95%以上［31］，還具有使用方便，營養元素豐富，改善土壤條件，提升作物生產質量，改善作物根系微生物群等特點［32-34］，為樹體的生長提供了良好的土壤環境，從而促進了果樹的株高和地徑，張奇等［35］研究發現生物有機肥在施用量為6 750 kg/hm2時土壤養分含量和生物功能改善效果明顯，作物產量在短期內可以顯著得到提升，本試驗研究也發現海藻有機肥在施用量為11 250 kg/hm2、葡萄籽有機肥在施用量為4 500 kg/hm2時可以明顯提高紅富士果樹的產量，且果實品質優良，這可能與生物有機肥處理可以改善土壤性質，提高土壤養分含量有 關［36］，這與姜潔等［37］研究結果一致。

3.2 生物有機肥對紅富士土壤微生物群落的分析

微生物群落在土壤有機質分解和營養元素循環中有著至關重要的作用，因此，土壤微生物群落的數量、結構和活性與生態系統功能密切相關，只有健康、良性循環的土壤生態環境才能保證植物的健康生長［38］，曲成闖等［39］、袁英英等［40］研究表明，施用生物有機肥可以提高黃瓜和西紅柿土壤的酶活性，調控土壤微生物群落結構，增強土壤微生物生態系統的穩定性。隨著分子生態學研究技術的發展，高通量測序技術成為了研究土壤微生物多樣性和群落結構特征的重要途徑［41］，本研究利用高通量測序技術對施加生物有機肥后不同土層的土壤進行研究發現，施加生物有機肥之后增加了0～20 cm土層細菌的多樣性和豐富度，減少了真菌的豐富度和多樣性，對于20～40 cm土層，海藻肥處理后減少了土壤細菌和真菌的豐富度和多樣性；葡萄籽肥處理則提高了土壤細菌和真菌的豐富度和多樣性，這劉振香等［42］的研究結果一致；賀文員等［43］研究發現施加生物有機肥（QD）之后變形菌門（Proteobacteria）、子囊菌門（Ascomycota）分別是細菌和真菌中的優勢物種，α-多樣性分析顯示QD使用前后真菌的多樣性顯著減少，這與本試驗研究結果一致，施用海藻肥處理后不同土層子囊菌門的相對豐度上升，施用葡萄籽肥處理后0～20 cm 土層子囊菌門的相對豐度上升，20～40 cm土層子囊菌門的相對豐度下降；子囊菌門大多數為腐生菌，可以分解木質素、角質素等難降解的有機質，在養分循環中擔任著重要角色［44-45］；酸桿菌門能夠降解復雜的木質素和纖維素，為土壤提供養分，還會分泌植物激素IAA從而促進作物生長［46-47］， 變形菌包括了能與植物共生的固氮細菌，對土壤氮、磷、硫和有機質循環有重要作用［48］，本試驗研究結果發現，海藻肥處理0～20和20～40 cm土層酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度提高，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度降低；葡萄籽肥處理后降低了0～20和20～40 cm土層酸桿菌門的相對豐度，提高了0～20 cm土層變形菌門的相對豐度，降低了20～40 cm土層變形菌門的相對豐度。土壤物種豐度聚類熱圖結果顯示，海藻肥和葡萄籽肥處理后在屬水平上細菌差異較小，真菌中被孢霉屬（Mortierella）和酵母屬（Guehomyces）明顯增加，李發虎等［49］研究發現施入生物炭后增加了被孢霉科真菌比例，可促進土壤有機質和養分含量的提高，從而利于黃瓜根系生長并提高根系體積。被孢霉屬是一類可以產生多烯不飽和脂肪酸，如花生四烯酸的真菌，被廣泛應用于食品、飼料和醫用領域［50］，還具有溶解土壤中磷的功能［51］，酵母屬（Guehomyces）也屬于有益菌，可以有效抑制致病菌對于植物的傷害，此外，酵母屬菌種還有一定的重金屬吸附作用，可以有效減少重金屬對植物的傷害［52-53］。綜上所述，生物有機肥的使用一定程度上對果園土壤的改良產生了積極的影響。

4 結論

生物有機肥（海藻肥和葡萄籽肥）處理后提高了樹體的株高、冠徑和產量，且果實品質優良；海藻肥處理后樹體長勢、葉叢枝和短果枝比例、平均單果質量以及果實品質均優于葡萄籽肥，但其公頃產量低于葡萄籽肥。

海藻肥處理后0～20和20～40 cm土層酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度提高，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度降低；葡萄籽肥處理后降低了0～20和20～40 cm土層酸桿菌門的相對豐度，提高了0～20 cm土層變形菌門的相對豐度，降低了20～40 cm土層變形菌門的相對豐度，擬桿菌門相對豐度的變化與變形菌門相反。值得注意的是，海藻肥處理后20～40 cm的第一大優勢菌門是酸桿菌門，其他處理的第一大優勢菌門是變形菌門。

子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）是土壤中含量最豐富的兩大真菌群落，與45%有機肥處理相比較，對0～20 cm土層來說，海藻肥和葡萄籽肥處理均提高了子囊菌門的相對豐度，其相對豐度表現為G_1>F_1>E_1，降低了接合菌門的相對豐度，其相對豐度表現為E_1>F_1>G_1；對20～40 cm土層來說，海藻肥和葡萄籽肥處理均提高了接合菌門的相對豐度，其相對豐度表現為G_1>F_1>E_1，其中海藻肥處理提高了子囊菌門的相對豐度，較CK提高了56.88%，葡萄籽肥處理降低了子囊菌門的相對豐度。

海藻肥和葡萄籽肥處理后增加了0～20 cm土層細菌的多樣性和豐富度，減少了真菌的豐富度和多樣性，3種生物有機肥處理土壤細菌Simpson優勢度指數以G最高，達到0.055 3；對于20～40 cm土層，海藻肥處理后減少了土壤細菌和真菌的豐富度和多樣性；葡萄籽肥處理則提高了土壤細菌和真菌的豐富度和多樣性。