原發(fā)性肝癌中CD133和EpCAM蛋白表達(dá)與阿帕替尼療效的關(guān)系研究

常 健，陳仁旺，楊盛力，胡建莉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430022

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2010年中國(guó)腫瘤注冊(cè)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肝癌發(fā)病率和病死率均躍居全球第一，發(fā)病例數(shù)約占全球55%，死亡人數(shù)占50%，在與腫瘤相關(guān)的死亡中僅次于肺癌，居第二位[1]。對(duì)于原發(fā)性肝癌，手術(shù)仍是首選的治療方式，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。對(duì)于晚期肝癌患者，全身治療(包括化療、靶向治療)、經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化學(xué)治療(transarterial chemoembolization，TACE)、射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)及中醫(yī)藥治療等手段可提高患者的生存率，對(duì)改善患者生活質(zhì)量有一定幫助，但遠(yuǎn)期療效仍有待提高[2]。

目前索拉非尼是晚期肝癌患者有效的治療手段，但索拉菲尼只能將晚期肝癌患者的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)3個(gè)月。而且價(jià)格昂貴，無(wú)法從大量的患者中挑選有效人群，限制了其在臨床上的使用[3]。隨著抗血管生成藥物的發(fā)展，作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)信號(hào)通路的抗腫瘤藥物越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。其中甲磺酸阿帕替尼(商品名：艾坦)是一種新型口服小分子抗血管生成制劑，可高度選擇性結(jié)合并抑制VEGFR-2，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。雖然目前尚未批準(zhǔn)該藥用于除晚期胃癌以外的其他惡性腫瘤的治療，但已在多種實(shí)體瘤中開(kāi)展了臨床研究[4-5]。

Reya等提出腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論，腫瘤組織中有少量細(xì)胞具有不確定的自我更新、多向分化潛能及產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的能力[6]，CSCs的存在是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗的重要原因。越來(lái)越多的證據(jù)表明，肝癌組織中存在一小部分具有CSCs特性的癌細(xì)胞，即肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。近年來(lái)LCSCs特異性標(biāo)志物的鑒定和針對(duì)靶向治療的靶點(diǎn)是研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)鑒定了幾種LCSCs標(biāo)志物，包括白細(xì)胞分化抗原133(CD133)、CD90、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、CD13、CD47和角蛋白19等[7-11]。

本研究分析甲磺酸阿帕替尼一線治療晚期原發(fā)性肝癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)及肝癌組織干細(xì)胞表型特征，并分析可能影響預(yù)后的因素，試圖探索一種晚期原發(fā)性肝癌一線治療的新的、有明確適應(yīng)人群的治療手段，造福廣大晚期原發(fā)性肝癌患者。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2015年2月至2017年8月經(jīng)病理確診為Child-Pugh A級(jí)的晚期肝細(xì)胞癌(HCC)患者33例，均使用一線單藥甲磺酸阿帕替尼治療，未聯(lián)合其他抗腫瘤治療。劑量為250～500 mg/d，餐后半小時(shí)口服，連續(xù)服用，直至出現(xiàn)不可耐受的不良反應(yīng)或疾病進(jìn)展。

1.2 免疫組化方法33例肝癌組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度切片。抗體分別是抗人CD133(目錄號(hào)：ab216323)、CD90(目錄號(hào)：ab133350)和EpCAM(目錄號(hào)：ab223582)小鼠單克隆抗體，均購(gòu)自Abcam公司。陽(yáng)性判斷參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[12-13]。根據(jù)具有陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)/膜染色的腫瘤細(xì)胞的比例，對(duì)CD133表達(dá)水平進(jìn)行半定量評(píng)分，0分(陰性)：<1%的腫瘤細(xì)胞染色；1分：弱染色比例≥1%；2分：中度染色比例≥1%；3分：強(qiáng)染色比例≥1%。染色得分2分和3分被定義為陽(yáng)性染色，而0分和1分被視為陰性染色[12]。

1.3 隨訪及療效評(píng)價(jià)隨訪截止時(shí)間為2018年3月。用藥后根據(jù)患者用藥前后的影像學(xué)資料，按照mRECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定其療效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(范圍)或絕對(duì)頻率(%)表示。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床生化資料33例患者中，男31例，女2例，男女比例為15.5∶1.0。發(fā)病年齡27～76歲，平均年齡50.4歲。患者基本臨床特征見(jiàn)表1。33例患者腫瘤組織中CD133、CD90和EpCAM的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)分別為16例、17例和17例(見(jiàn)圖1)。

表1 33例肝癌患者臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of 33 patients with liver cancer

圖1 肝癌組織中CD133和EpCMA陽(yáng)性表達(dá)的免疫組化結(jié)果(SABC，200×) A： CD133陽(yáng)性表達(dá)； B： EpCMA陽(yáng)性表達(dá)Fig 1 Immunohistochemical results of positive expression of CD133 and EpCMA in liver cancer tissues (SABC，200×) A： CD133 positive expression； B： EpCMA positive expression

2.2 分組及相關(guān)預(yù)后指標(biāo)將33例患者分為PFS≤3個(gè)月組(11例)和PFS>3個(gè)月組(22例)，分別與肝癌組織中CD133、CD90和EpCAM的陰性和陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，CD133和EpCAM的陽(yáng)性表達(dá)與PFS長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)(見(jiàn)表2)。

表2 與PFS相關(guān)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物分析Tab 2 Analysis of predictive markers related to PFS

對(duì)33例病例進(jìn)行生存分析，PFS為(2.8±0.3)個(gè)月(95%CI：2.24～3.33)。分別以肝癌組織中CD133、CD90和EpCAM的陰性和陽(yáng)性表達(dá)分組進(jìn)行生存分析，生存曲線顯示，CD133陰性組PFS(3.5±0.4)個(gè)月高于陽(yáng)性組(2.1±0.3)個(gè)月(P<0.05)。生存曲線顯示，EpCAM陰性組PFS(3.5±0.3)個(gè)月高于陽(yáng)性組(2.0±0.3)個(gè)月(P<0.05)。生存曲線顯示，CD90陰性組PFS與CD90陽(yáng)性組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。提示：腫瘤組織CD133、EpCAM的陰性和陽(yáng)性表達(dá)均可影響患者生存率，對(duì)HCC評(píng)估預(yù)后具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

圖2 Kaplan-Meier法分析一線使用甲磺酸阿帕替尼的晚期肝癌患者肝癌組織中CD133、EpCAM、CD90的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Kaplan-Meier plots for analysis of the relationship between the expressions of CD133, EpCAM, and CD90 in liver cancer tissues and prognosis in patients with advanced liver cancer who used Apatinib mesylate in the first line

肝癌組織中CD133和EpCAM的表達(dá)可用于預(yù)測(cè)甲磺酸阿帕替尼的療效。圖3所示3例患者，分別是CD133、CD90和EpCAM均陰性，CD133陽(yáng)性，CD133、EpCAM均陽(yáng)性，甲磺酸阿帕替尼治療3個(gè)月后的療效分別是疾病進(jìn)展(PD)、疾病穩(wěn)定(SD)和部分緩解(PR)。

注：病例1：CD133、CD90、EpCAM均為陰性；病例2：CD133陽(yáng)性、CD90和EpCAM陰性；病例3：CD133、EpCAM陽(yáng)性，CD90陰性。

3 討論

近年來(lái)，肝癌的治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但晚期HCC患者的總體預(yù)后仍較差，如果僅給予最佳支持治療，歐美患者的的平均生存時(shí)間為6～9個(gè)月，而亞洲患者(除日本外)的生存期僅為3～4個(gè)月[14-17]。兩項(xiàng)大型、隨機(jī)對(duì)照的國(guó)際多中心臨床試驗(yàn)SHAPR和Oriental研究結(jié)果表明，索拉菲尼能夠延長(zhǎng)晚期HCC患者生存時(shí)間，因此索拉非尼已獲批得180多個(gè)國(guó)家和地區(qū)藥監(jiān)部門(mén)的批準(zhǔn)，用于無(wú)法手術(shù)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期HCC患者，但由于索拉非尼總體客觀有效率低，生存獲益有限、毒副作用較多、價(jià)格昂貴且無(wú)有效的療效預(yù)測(cè)因子，極大地限制了臨床上的廣泛應(yīng)用，因此，對(duì)于晚期HCC患者亟需尋找新的有效治療藥物[18]。

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，腫瘤組織需依賴新生血管提供的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿足腫瘤細(xì)胞不斷擴(kuò)增的需要，因此對(duì)于腫瘤血管的干預(yù)能夠有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)[19]。甲磺酸阿帕替尼可高度選擇性地結(jié)合并抑制VEGFR-2，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[20-24]。但目前應(yīng)用的包括索拉菲尼在內(nèi)的肝癌靶向治療藥物尚無(wú)有效的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特征的許多方面已經(jīng)被揭示。然而，其生物學(xué)作用和機(jī)制仍有待闡明，基于腫瘤干細(xì)胞的肝癌診斷和根除腫瘤干細(xì)胞的治療均需進(jìn)一步研究。肝癌細(xì)胞具有多種生物標(biāo)志物的異質(zhì)性癌細(xì)胞，但治療一般是根據(jù)臨床分期選擇的，因此希望能通過(guò)各種標(biāo)志物的組合對(duì)患者進(jìn)行詳細(xì)分類，以便提供最佳治療方案。因此，本研究通過(guò)回顧性分析近兩年我院腫瘤中心應(yīng)用甲磺酸阿帕替尼治療晚期一線原發(fā)性肝癌的患者資料，尋找到能夠預(yù)測(cè)其治療療效的腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)志物，為醫(yī)師在臨床上選擇合適的患者用藥提供指導(dǎo)，避免無(wú)效治療和無(wú)謂的經(jīng)濟(jì)損失。

目前報(bào)道的索拉菲尼治療晚期原發(fā)性肝癌的PFS為3～4個(gè)月，本研究的結(jié)果顯示，甲磺阿帕替尼聯(lián)合最佳支持治療一線治療晚期原發(fā)性肝癌的PFS達(dá)到(2.8±0.3)個(gè)月。進(jìn)一步分析肝癌組織CD133和EpCAM的陰性陽(yáng)性表達(dá)均可影響患者的疾病進(jìn)展時(shí)間，對(duì)HCC評(píng)估預(yù)后具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

本研究將33例取得肝癌組織標(biāo)本的患者分為PFS≤3個(gè)月組和PFS>3個(gè)月組，分別與肝癌組織中幾個(gè)分子標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果提示肝癌組織CD133和EpCAM的陽(yáng)性表達(dá)與PFS長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)。提示以上因素可能與甲磺酸阿帕替尼治療晚期肝癌療效相關(guān)，可以為臨床用藥選擇提供指導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CD133和EpCAM的表達(dá)可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)，這與本研究的結(jié)果相符合[23-24]。因此肝癌組織中CD133和EpCAM的表達(dá)水平可用于靶向藥物選擇相關(guān)的特定靶點(diǎn)治療和預(yù)測(cè)標(biāo)記。在臨床上采用免疫組化這種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可靠的分析方法檢測(cè)這兩種蛋白的表達(dá)，從而為臨床選擇用藥提供指導(dǎo)非常有現(xiàn)實(shí)意義。本研究為回顧性的、病例數(shù)較少，而且治療方式之間存在交叉，同時(shí)部分病例隨訪時(shí)間較短，需要進(jìn)一步隨訪后分析。

綜上分析，甲磺阿帕替尼在晚期原發(fā)性肝癌患者中具有一定臨床療效，是晚期原發(fā)性肝癌患者的一種治療選擇，有一定的療效預(yù)測(cè)因素。但目前相關(guān)臨床研究仍較少，其療效及其預(yù)測(cè)指標(biāo)仍需更大規(guī)模的臨床研究。期待有更多的數(shù)據(jù)加以證實(shí)。