稻草還田對煙田追肥氣態氮損失及相關微生物的影響

劉青麗，李志宏，陳順輝，蔣雨洲，張云貴，李文卿※

（1.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；2.福建省煙草專賣局煙草科學研究所，福州 350003）

0 引 言

N2O和NH3是氮肥氣態損失的主要途徑[1]，排放到大氣中的 N2O是主要溫室氣體之一，NH3對大氣中氣溶膠的形成具有促進作用[2-3]。研究不同農業措施下N2O和 NH3的排放，對減緩溫室效應及霧霾治理有重要意義[4-5]。秸稈還田是改良土壤結構、提高土壤肥力的重要農業措施。秸稈還田能夠改變土壤微生物群落結構[6-7]，提高氮素循環相關的功能基因豐度[8]，改變土壤碳氮轉化[9]，影響N2O 和NH3的排放。有研究顯示，秸稈還田使N2O排放和NH3揮發增加[10-11]，但也有研究認為秸稈還田降低了N2O排放[12]和NH3揮發損失[13]。Shan等[14]整合了112個農作物秸稈還田對 N2O排放的影響后指出，秸稈還田對于 N2O 排放的影響范圍受氮肥施用、秸稈類型等影響較大。此外，輪作模式、灌溉方式和還田方式均導致了 N2O排放的差異[15-17]，致使秸稈還田對N2O的影響還存在爭議[18]。這些研究多是針對秸稈還田對N2O或NH3排放的單獨影響，秸稈還田對N2O和NH3的綜合影響少有研究。烤煙是福建重要的經濟作物，其追肥常采用澆施的方式，同時，為了提高煙葉質量，稻草還田常與餅肥配合施用，在這種管理方式下，N2O和 NH3揮發的規律尚不清楚。因此本研究以水稻烤煙輪作定位試驗為平臺，研究稻草還田及其配施餅肥對追肥氣態氮損失的影響，為氮肥高效利用及綠色生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

福建煙草科學研究所的水稻烤煙輪作長期定位試驗區位于福州晉安區，于2008年水稻收割后設立。試驗田土地平整，土壤類型為水稻土，質地為砂壤土。2008年水稻收割后0～20 cm 耕層土壤有機質為28.96 g/kg、堿解氮 144.66 mg/kg、速效磷 5.85 mg/kg、速效鉀142.43 mg/kg、pH值 5.76。該區屬典型的亞熱帶季風氣候，年平均日照數為 1 700～1 980 h，年平均降水量為900～2 100 mm，年平均氣溫為20～25 ℃，最冷月1—2月，平均氣溫6～10 ℃；最熱月7—8月，平均氣溫為33～37 ℃。本研究以該定位試驗區為平臺，于2017年開展相關研究。2017年烤煙生長季氣溫和降雨如圖1所示。

圖1 烤煙生長季氣溫和降雨Fig.1 Temperature and rainfall during tobacco growing season

1.2 試驗設計

由于定位試驗設計之初是針對目前生產上常見的幾種施肥措施進行長期定位試驗比較，未涉及不施肥處理，因此本研究在定位試驗中選擇 3個常見施肥處理，分別為：僅施化肥（NPK），化肥+稻草還田（NPKS）和化肥+稻草還田+餅肥處理（NPKSB）。每小區240 m2，另加一定保護行，不設重復。為了增加數據的可信度，在每個小區不同位置進行了3次重復采樣。

化肥氮投入量及方法：3個處理化肥投入量相同，烤煙生長季施化肥氮 97.5 kg/hm2，N：P2O5：K2O ＝ 1：0.75：2.63。化肥分2次基肥和4次追肥施入，其中基肥1（專用肥，N∶P2O5∶K2O=12∶8∶22）于移栽前 1周條施于距離壟面15 cm深的位置，基肥2（鈣鎂磷肥,和復合肥，復合肥 N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）為穴肥，于移栽時施用；追肥澆施，第1～2次追肥施用專用肥，第3～4次追肥施用專用肥和硫酸鉀。基肥1和基肥2于1月24日施用，N投入量分別為56.7 和4.5 kg/hm2；追肥1～4分別于2月1日、2月26日、3月6日、3月16日施用，N投入量分別為4.5、4.5、13.5和13.5 kg/hm2。

稻草還田：晚稻收割后將所有稻草粉碎后均勻撒回田間，灌水溶田，移栽前1個月左右排水，曬干后起壟。水稻秸稈全氮為 8.39 g/kg、全磷為 1.54 g/kg、全鉀為15.06 g/kg。

餅肥：菜籽餅肥，于移栽前穴施，施用量為300 kg/hm2。餅肥全氮為 39.10 g/kg、全磷為 10.70 g/kg、全鉀為11.92 g/kg。

1.3 田間管理

烤煙品種為翠碧1號，于2017年1月24日移栽，種植密度為16 500株/hm2。NPK和NPKS處理于6月12日采收結束，NPKSB處理于6月20日采收結束。除澆施肥料外，整個生長季均無灌溉，覆膜、打頂等其他農藝措施同大田常規管理。

1.4 樣品采集與測試方法.

1.4.1 氨揮發采集與測試

氨揮發采用密閉室連續抽氣法測定。密閉室采用透明有機玻璃材料制作，長×寬×高為60 cm×50 cm×15 cm，密閉室真實高度根據壟高和插入泥土中的深度調整。通過抽氣減壓方式使密閉室中的空氣通過硼酸吸收液從而將其中的氨吸收固定，用標準酸（0.001 mol/L的H2SO4）滴定硼酸計算所吸收的氨。于上午 09:00—10:00用電動泵抽取采集氨氣。每次追肥后1、2、3、5、7、10和15 d采樣，超過15 d后，每隔15 d采集1次。

1.4.2 N2O采集與測試

采用靜態箱-氣象色譜法測定 N2O。靜態箱設置如圖2[11]所示，靜態箱底座尺寸為60 cm×50 cm×30 cm，箱體尺寸60 cm×50 cm×15 cm。每個小區內分別固定3個底座，煙株在底座的中央；取樣時將箱體小心放置嵌入底座凹槽內，用水密封，保證箱體內外空氣不發生交換。在0～45 min內每間隔15 min用50 mL 注射器采集氣體，迅速轉移到250 mL鋁膜氣樣袋中（大連光明化工研究所生產）。為了降低每天溫度變化的影響，每次采樣在上午 08:00—10:00時間段進行。采樣時間和采集頻率同氨揮發測試，取樣后盡快完成樣品測定。N2O濃度采用氣相色譜（HP 7890A, 美國安捷倫公司）測定。

圖2 測定高桿作物生態系統溫室氣體排放的組合式采樣箱Fig.2 Combined sampling box for measuring greenhouse gas emissions in high stem crop ecosystem

1.4.3 土壤樣品采集與微生物測定

烤煙收獲后，將煙根拔出，取煙株穴內深0～20 cm土壤。每個處理小區各取樣3 次重復，剔除雜質后并過2 mm篩，裝于封口袋冷凍保存。土壤樣品由北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序，準確稱取 0.25 g土壤樣品，使用MOBIO公司的試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit）提取土壤DNA。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（美國AXYGEN公司）切膠回收 PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物采用Caliper LabChip儀器，用熒光定量試劑HT DNA 1K Reagent Kit，PerkinElme進行檢測定量。將純化的DNA后通過Illumina平臺的MiSeq進行高通量測序。

1.4.4 土壤采集及無機氮測定

烤煙進入旺長期開始（3月8日），每隔2周用土鉆取2株煙中間表層（0～20 cm）土壤樣品，每小區采集5鉆混合均勻放入自封袋，帶回實驗室冷凍保存，測定土壤無機氮含量及土壤含水率。

1.5 數據統計

1）N2O排放計算[12]

N2O排放速率（k）：

式中C為N2O濃度，mL/m3；t為測定時長，min；該線性方程的斜率k代表了N2O排放速率，mL/（m3·min)；C0為常數。

N2O排放通量（F）：

式中F為N2O的排放通量，kg/(hm2·d)；60為時間換算常數；H為采樣箱的有效高度，cm；T為采樣時箱內平均氣溫，℃； 44為N2O的摩爾質量，g/mol；0.24為 mg /(m2·h) 轉化為 kg/(hm2·d)的系數；A為靜態箱的截面積，m2；D為單株面積，m2；A/D為施肥面積系數。

烤煙生長季N2O排放總量（M）：

式中M為烤煙第一次追肥至采收結束N2O累積排放量，kg/hm2；i為采樣次數；L為移栽后天數，d。

2）氨排放計算

氨揮發速率（Ni）：

式中Ni為氨揮發速率，kg/(hm2·d)，Ng為通氣法單個裝置氨揮發氮累積量，kg。

氨揮發累積量（N）：

3）肥料氮氣態損失率

式中Lck為對照氣態氮損失，kg/hm2；Nmin每次追肥氨揮發速率最低值，kg/(hm2·d)；Fmin是每次追肥N2O排放速率最低值，kg/(hm2·d)；Loss為肥料氮氣態損失率，%。

4）數據處理

試驗數據經Excel 2013整理后，應用Graphpad Prism 8.0作圖，并用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。顯著性檢驗均采用Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理下土壤含水率及無機氮含量

土壤含水率是影響作物生長和養分轉化的重要參數，稻草還田對土壤含水率影響顯著，與NPK處理相比，NPKS和 NPKSB處理土壤含水率可以提高 8.4%～10.1%。通過不同時期配對檢驗統計分析顯示（圖3a），NPKS和NPKSB處理土壤含水率顯著高于NPK處理，表明稻草還田可以提高土壤含水率。土壤無機氮含量是土壤供氮的重要指標，其隨著烤煙生長逐漸降低，至 4月底5月初降至低水平且保持穩定（圖3b），方差分析顯示不同處理土壤無機氮含量差異顯著，追肥初期NPKS處理土壤無機氮顯著低于NPK處理，而通過配對檢驗統計分析顯示，NPKSB處理顯著高于NPK和NPKS處理，表明稻草還田對土壤無機氮有短暫的固定作用，而稻草還田配施餅肥則可以提高土壤無機氮含量。

圖3 煙田土壤含水率及無機氮含量Fig.3 Soil moisture content and inorganic nitrogen content in tobacco field

2.2 烤煙追肥后氣態氮排放動態

2.2.1 氨揮發動態

為了提高肥料利用率，烤煙追肥采用水肥混合后澆施的方法，烤煙追肥分 4次進行。追肥后氨揮發動態（圖4a）顯示，每次追肥后氨揮發速率迅速增加，第2天氨揮發速率達到最大，之后迅速下降，第8天降到最低。從不同時間來看，第 1、2次追肥后，氨揮發速率由高到底依次為NPK、NPKSB、NPKS，第3次由高到底依次為NPK、NPKS、NPKSB，第4次由高到底依次為NPKS、NPKSB、NPK，表明秸稈還田初期，秸稈對抑制氨揮發的作用較強，隨著時間的延長抑制作用減弱。從整個生長季來看，NPK、NPKS、NPKSB處理的日氨揮發速率分別為0.004～0.035、0.003～0.019 和 0.003～0.025 kg/hm2；統計分析顯示，NPK、NPKS、NPKSB處理的氨揮發速率的變異系數分別為46.54%、38.65%和45.54%，表明稻草還田降低了氨揮發速率的波動幅度。

2.2.2 N2O排放動態

從圖4b可以看出，煙田N2O排放速率呈波動式變化，NPK、NPKS、NPKSB處理的日排放速率分別為0.001～0.193、0.001～0.248 和 0.001～0.273 kg/hm2；其變異系數分別為85.19%、75.68%、84.94%。從不同時間來看，第1、2次追肥后N2O排放速率低于第3、4次，這是由于后者的施肥量高于前者。從每次追肥來看，追肥后N2O排放開始增加，2～3 d后排放速率達到最大，之后開始下降；但在追肥1和追肥3后期出現了 N2O排放的升高，這可能是由于降雨引起。不同處理施肥后表現為NPKS和NPKSB的N2O排放速率高于NPK；與NPK處理相比，稻草還田（NPKS和NPKSB）使施肥后N2O排放速率上升速度加快、下降速度比單施化肥慢。

圖4 烤煙追肥后氣態氮損失動態Fig.4 Gaseous nitrogen emission dynamics of tobacco after topdressing

2.3 煙田氣態氮損失

2.3.1 氣態氮損失量

從第1次追肥至烤煙生長結束，氮肥的氣態損失量如圖5a所示。NPK 處理氨揮發氮量為（1.45±0.04）kg/hm2，NPKS和 NPKSB處理氨揮發氮量顯著低于NPK處理（p＜0.05），分別減少了 11.43%和 8.91%，NPKS處理和NPKSB處理氨揮發氮量差異不顯著，表明稻草還田能夠抑制肥料氨揮發。不同處理 N2O排放量表現與氨揮發不同。NPK處理 N2O排放氮量為(2.49±0.23) kg/hm2，NPKS處理N2O-N量顯著高于NPK處理，N2O排放量增加了55.35%；NPKSB處理N2O-N排放量與NPK處理差異不顯著，但其顯著低于NPKS處理（P＜0.05），N2O排放量降低了 27.82%，表明稻草還田使煙田 N2O排放量升高；而稻草還田和餅肥配施降低了稻草還田對 N2O排放的激發效應。NPK、NPKS和 NPKSB處理 NH3-N和 N2O-N總量分別為（3.94±0.38）、（5.15±0.50）和（4.11±0.28）kg/hm2，NPKS處理顯著高于 NPK和NPKSB處理（P＜0.05），綜合來看稻草還田顯著增加了氣態氮損失。

2.3.2 肥料氮氣態損失率

在水肥混合澆施下（圖5b），NPK處理肥料氮氣態損失率為6.97%±1.07%，其N2O排放損失率為4.81%±1.13%，其占氣態氮的62.98%，表明氣態損失以N2O排放為主。NPKS處理肥料氮氣態損失率顯著高于 NPK處理，為10.34%±1.40%，其顯著降低了氨揮發損失率，提高了N2O排放損失率，其 N2O排放損失占肥料氮氣態損失的77.07%。NPKSB處理肥料氮氣態損失率與NPK處理差異不顯著，為 7.45%±0.77%，其顯著降低了氨揮發損失率，對N2O排放損失率無顯著影響，其N2O排放損失占肥料氮氣態損失的67.96%。

圖5 煙田追肥后氣態氮損失Fig.5 Loss of gaseous nitrogen in tobacco field after topdressing

2.4 不同施肥處理對土壤氮轉化基因微生物群落的影響

反硝化過程的最后一步即N2O被還原為N2的過程，由氧化亞氮還原酶催化完成，編碼該酶的基因是nosZ，這也是生物圈中唯一已知的可將N2O還原為N2的生物過程。從圖6a可以看出，水稻//煙草土壤nosZ基因微生物主要由變形菌門的甲型變形菌綱的根瘤菌目和紅螺菌目組成，其次是β變形菌綱的伯克爾霍爾德氏菌目和紅環菌目。不同處理nosZ基因微生物群落結構差異顯著，NPKS處理根瘤菌目相對豐度顯著低于NPK處理，NPKSB處理的伯克爾霍爾德氏菌目相對豐度顯著高于NPK處理。

氨氧化細菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）屬于專性化能自養的功能微生物，通過氨單加氧酶催化作用將氨氧化成羥胺，此步驟是硝化作用過程的起始和限速步驟。從圖6b可以看出，水稻烤煙輪作土壤AOB基因微生物群落主要由變形菌綱的亞硝化單包菌目組成，其相對豐度達到了60%以上，NPKS和NPKSB處理亞硝化單包菌目相對豐度（圖6b）均顯著高于NPK處理，表明稻草還田改變了AOB基因的微生物群落組成，提高了亞硝化單包菌目的相對豐度。

圖6 水稻烤煙輪作土壤微生物群落結構Fig.6 Microbial community structure of rice to bacco rotation soil

2.5 氣態氮損失與氮轉化基因微生物群落、土壤養分、土壤含水率的關系

通過Pearson相關分析顯示（表1），氨揮發氮損失與nosZ基因和AOB基因微生物群落結構無顯著相關性，與土壤有機質、土壤含水率顯著負相關。N2O排放與根瘤菌目呈極顯著負相關、與紅螺菌目呈顯著正相關。

表1 NH3揮發、N2O排放與氮轉化基因微生物群落、土壤養分、土壤含水率的關系Table 1 Relationship between NH3 volatilization, N2O emission and microbial community of nitrogen transformation gene, soil nutrient and soil moisture content

3 討 論

土壤NH4+-N 和NO3--N 是有效氮的主要存在形式，是氨揮發和N2O排放的重要來源。秸稈還田直接影響土壤氮素的有效性[19]，添加低C/N的作物秸稈會激發土壤氮礦化，添加高 C/N的作物秸稈可以在分解過程中暫時固定土壤氮素[20]。稻草還田與化肥配施處理對無機氮有短期的固定作用，導致施肥后土壤無機氮含量短期內低于單施化肥處理；餅肥的碳氮比（C/N）遠低于稻草，在稻草與餅肥混施下，由于C/N比降低，促進了土壤氮礦化，使無機氮含量顯著高于稻田還田處理。

土壤水分狀況影響土壤中O2的含量及通氣狀況，同時也影響硝化反硝化過程的發生和N2O在土壤中的擴散[21]，一般土壤含水率越高反硝化作用越強、硝化作用減弱。同時土壤含水率還影響土壤氨揮發，本研究相關分析顯示，氨揮發量與土壤含水率呈極顯著負相關。秸稈還田通過影響土壤孔隙度的大小與數量，調控土壤-大氣-作物三者之間的水分傳導[22]。本研究顯示，稻草還田使土壤含水率提高了8.4%～10.1%，這也是稻草還田激發N2O排放、降低氨揮發的原因之一。

稻草還田抑制了土壤氨揮發，與單施化肥相比，氨揮發氮量顯著降低了11.43%；NPKSB處理較NPK處理氨揮發氮量減少了8.91%，這與以往的研究結果相一致[13,17]。氨揮發量與土壤有機質含量呈顯著負相關，長期稻草還田能夠增加有機碳，使土壤有機質提高，有機質對NH4+吸附能力較強，降低NH4+濃度，從而減少NH3揮發[23]，另一方面，秸稈還田提高了田間土壤水分含量，導致液相中NH4+濃度降低[24]。

硝化作用和反硝化作用是土壤排放N2O 的2個最重要的途徑。硝化作用是全球氮循環中非常關鍵的環節，包括2個轉化過程：第1步是將氨氧化成亞硝酸，第2步是將亞硝酸氧化成硝酸，在整個氮素的轉化過程中由氨氧化細菌（AOB）進行的第 1步氧化過程，是生態系統中氮素循環的限速步驟[25]，秸稈還田改變了AOB功能基因的微生物群落結構，稻草還田及稻草還田配施餅肥處理使AOB菌群的亞硝化單包菌目相對豐度顯著高于化肥處理。土壤反硝化過程需要多種酶進行連續反應，其中編碼氧化亞氮還原酶的nosZ基因是常用反硝化標識物之一。本研究顯示，N2O排放與根瘤菌目相對豐度極顯著負相關、與紅螺菌目相對豐度顯著正相關。而稻草還田使nosZ基因菌群的根瘤菌目相對豐度降低、紅螺菌目相對豐度升高，激發了N2O排放。另一方面大量秸稈直接還田后，在秸稈腐解過程中使土壤中氧氣含量降低，從而使反硝化作用增強、N2O排放量增加[26]。

稻草還田餅肥處理（NPKSB）根瘤菌目、紅螺菌目相對豐度與對照差異不顯著，表明配施餅肥可以降低稻草還田對反硝化微生物的影響，從而降低了N2O排放。同時該處理伯克霍爾德氏菌目相對豐度均顯著高于 NPK和 NPKS處理。伯克霍爾德氏菌具有促進植物生長和發育的潛力[27]，通過棲息于作物根際提高作物養分吸收的方式增加作物產量[28-29]，餅肥的施用增加了伯克霍爾德氏菌目，促進了烤煙生長及對氮素養分的吸收，也是降低N2O排放的原因之一。綜合來看稻草還田顯著增加了氣態氮損失，而稻草還田配施餅肥可以降低稻草還田引起的氣態氮損失。

4 結 論

1）煙田追肥后土壤 NH3揮發和 N2O排放速率開始上升，2～3 d達到最大，之后開始下降。NPK處理氨揮發氮量為 1.45±0.04 kg/hm2，N2O 排放氮量為2.49±0.23 kg/hm2，氣態氮損失中以N2O排放為主。

2）稻草還田提高了土壤含水率8.4%～10.1%、對追肥氮有短期的固定作用，改變了硝化和反硝化微生物群落結構，其根瘤菌目相對豐度顯著降低、紅螺菌目相對豐度顯著升高；N2O排放量增加了55.35%、氨揮發氮量顯著降低了11.43%。

3）稻草還田配施餅肥處理提高了土壤含水率和土壤無機氮含量，改變了硝化和反硝化微生物群落結構，其伯克爾霍爾德氏菌目相對豐度顯著提高；氨揮發氮量顯著降低了8.91%，N2O排放量較化肥+稻草還田處理降低27.82%。