百合病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展?

楊 丹 趙斌安 許 燕 張 琪 吳文靜浦心祎 袁文天 趙悅琪 趙恒震 史 斌

（1 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200234 2 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院十院臨床醫(yī)學(xué)院 上海 200092 3 上海博滿生物科技有限公司 上海 201106）

百合，除了可食用、入藥外，還因美好寓意備受人們的喜愛。百合科百合屬為多年生植物，其繁殖方式主要靠無(wú)性繁殖技術(shù)——扦插、分球等，這種方式會(huì)使感染百合的病毒不斷傳代，在開放環(huán)境下擴(kuò)散感染其他植株，擴(kuò)大病毒傳播范圍，最終對(duì)花卉種植業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，百合脫毒苗制備和相應(yīng)病毒檢測(cè)技術(shù)對(duì)切斷病毒傳播、減少經(jīng)濟(jì)損失至關(guān)重要。

1 百合主要病毒種類及危害

在百合種植過(guò)程中，百合斑駁病毒（lily mot‐tle virus，LMoV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）與百合無(wú)癥病毒（lily symptomless vi‐rus，LSV）是最易感染百合、危害最大的3 種病毒。百合斑駁病毒和百合無(wú)癥病毒屬于線狀植物病毒，傳播廣、危害大，被我國(guó)明令禁止入境，是三類檢疫有害生物。黃瓜花葉病毒則造成葉萎縮黃化、變皺、莖變形等病癥。然而，上述3 種病毒常伴隨出現(xiàn)，導(dǎo)致百合花葉斑駁、花葉變形、植株矮化或無(wú)主桿、百合切花或鱗莖品質(zhì)不合格。

2 病毒形態(tài)觀察鑒定

病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和寄主病變情況清晰且直觀，是植物病毒鑒定和研究的重要依據(jù)。百合病毒的光學(xué)顯微診斷法是在光鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)、寄主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，以及病毒的復(fù)制和裝配等過(guò)程。隨著生命科學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和電子信息學(xué)的發(fā)展與相互滲透，電子顯微鏡技術(shù)包括負(fù)染色法（negative staining）、電 鏡 超 薄 切 片 法（electron microscopy ultrathin section）、免 疫 電 鏡 法（immuno special electronic microscope，ISEM）、膠體金免疫電鏡法（immunogold labeling）等逐漸成為主要研究手段，能提供更多的病毒信息。

梁巧蘭等[3]利用負(fù)染色和超薄切片技術(shù)，在電鏡下觀察百合病毒和內(nèi)含體形態(tài)、大小并配合間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）鑒定病毒侵染種類。電鏡檢測(cè)技術(shù)可直觀觀測(cè)到樣品，但需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，配備電鏡等精密昂貴設(shè)備及高超嫻熟的專業(yè)操作技能，因此，不適用田間大量樣本檢測(cè)[4]。

3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法將植物病毒作為抗原，注射至動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體。每種病毒產(chǎn)生的抗血清具有特異性識(shí)別功能，可根據(jù)已知病毒的抗血清檢測(cè)未知病毒。該方法靈敏度較高，但納克級(jí)別以下無(wú)法檢測(cè)，且需制備高質(zhì)量的抗血清，易出現(xiàn)假陰性。抗原抗體反應(yīng)具有專一性，但不同百合植株中病毒抗原會(huì)有所差異，常會(huì)漏檢某一病毒或某一株系病毒。此外，病毒感染植株也呈現(xiàn)不均勻分布、病毒分離多樣性及季節(jié)性差異，這些都會(huì)影響酶聯(lián)免疫的最終結(jié)果[5]。

4 分子生物學(xué)方法

4.1 PCR、RT-PCR 及多重PCR 技術(shù) 以核酸檢測(cè)為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)因高特異性、高靈敏度、快速、便捷的特性得到廣泛關(guān)注并被快速普及。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）：首先將雙鏈DNA 變性解旋成單鏈，在DNA 聚合酶的參與下，以單鏈DNA 為模板，特定引物為起點(diǎn)，利用4 種脫氧核苷酸，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成新的DNA，通過(guò)變性、退火、延伸等多個(gè)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)特定基因的體外放大。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）則是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶，將逆轉(zhuǎn)錄與基因擴(kuò)增在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行。而多重PCR 技術(shù)則是在同一反應(yīng)液中加入多對(duì)特定引物對(duì)，擴(kuò)增多段特定DNA 序列的過(guò)程。

鄒迎春等[6]依據(jù)公開的百合斑駁病毒、百合無(wú)癥病毒序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)了能擴(kuò)增出不同大小的目的片段的特異引物對(duì)，以18S rRNA 為內(nèi)參基因，優(yōu)化多重RT-PCR 反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)快速檢測(cè)多種病毒。該體系未檢測(cè)出其他病毒，特異性好，能分辨出2 種病毒和內(nèi)參基因。

PCR 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，但在PCR 檢測(cè)過(guò)程中，假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果仍常存在。在RTPCR 檢測(cè)時(shí)，因RNA 病毒逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中容易被RNA 酶污染，易出現(xiàn)假陰性。而多重PCR 技術(shù)因反應(yīng)液中存在多對(duì)引物對(duì)，擴(kuò)增時(shí)引物相互干擾，不同片段擴(kuò)增效率不同，短片段優(yōu)先擴(kuò)增，而且易出現(xiàn)人工片段，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，無(wú)法判斷是否存在假陽(yáng)性，有時(shí)需添加假陽(yáng)性檢測(cè)步驟。

4.2 基因芯片 基因芯片又稱生物芯片，該技術(shù)將序列一致的靶序列的探針固定在支持物表面，再與待測(cè)樣本中的源核酸雜交，最終，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度變化，對(duì)樣品序列信息進(jìn)行解讀和分析，高通量獲取相關(guān)生物信息[7]。賈慧等[8]根據(jù)百合無(wú)癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒及另外2 種常見的植物病毒——煙草花葉病毒和馬鈴薯Y 病毒的外殼蛋白基因，設(shè)計(jì)引物和寡核苷酸探針，通過(guò)芯片雜交反應(yīng)條件（變性處理、時(shí)間、溫度）及雜交組分和濃度的不斷優(yōu)化，制備高特異性基因芯片。但基因芯片技術(shù)屬于綜合性的高新技術(shù)，不僅需要昂貴的芯片制作系統(tǒng)，還需昂貴的激光共聚焦掃描儀輔助，且對(duì)操作人員的專業(yè)要求較高，這使得該技術(shù)的推廣受到了限制[9]。

4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP） 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由日本學(xué)者Notomi[10]提出，在恒溫條件下（65℃左右），具有鏈置換特性的Bst DNA 聚合酶的作用下，利用4 條可特異性識(shí)別靶基因上的6 個(gè)特異區(qū)域的引物（F3/B3 和FIP/BIP），可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的109～1010倍擴(kuò)增。

本實(shí)驗(yàn)室從百合斑駁病毒、百合無(wú)癥病毒、黃瓜花葉病毒的CP基因上尋找保守區(qū)域，選擇保守區(qū)域時(shí)避開所有的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)獲得LAMP 特異性引物，能識(shí)別靶序列上的6 個(gè)特異區(qū)域。建立的百合病毒的LAMP 和RT-LAMP 方法具有高特異性，與常見侵染百合的多種病毒無(wú)交叉，靈敏度高，可在模板純度只有10 個(gè)拷貝數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)添加SYBR GreenⅠ染料，肉眼可視，顯色為綠色的樣品為陽(yáng)性，含有百合病毒，顯色為橘色的樣品為陰性，不含百合病毒[11-12]。

LAMP 反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，受樣本質(zhì)量影響小，可省略DNA 或RNA 純化步驟[13]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)現(xiàn)有的環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)又進(jìn)一步優(yōu)化，即實(shí)現(xiàn)LAMP 試劑預(yù)分裝和配套的樣本直擴(kuò)技術(shù)，現(xiàn)場(chǎng)只需加樣1 次，無(wú)需電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用熒光進(jìn)行顯色判斷，陽(yáng)性產(chǎn)物為綠色，陰性產(chǎn)物為橘紅色。LAMP 反應(yīng)檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限為2 個(gè)拷貝，檢測(cè)時(shí)間為20 min。整個(gè)反應(yīng)只需要金屬浴或水浴鍋，3 支移液器即可操作，設(shè)備簡(jiǎn)單，總費(fèi)用6 000 元左右。

LAMP 試劑預(yù)分裝。在百級(jí)凈化車間，將試劑分裝為2 個(gè)部分，A 試劑吹干在管蓋上，B 試劑分裝在PCR 管中，封裝好。由于核酸染料在反應(yīng)前體系配制時(shí)加入，反應(yīng)后無(wú)需開蓋添加染料進(jìn)行顯色，避免因開蓋產(chǎn)生的氣溶膠污染。試劑放置室溫可長(zhǎng)達(dá)7 個(gè)月。

樣本直擴(kuò)技術(shù)意味著樣本進(jìn)一步處理即可直接加入反應(yīng)體系，無(wú)需進(jìn)行純化。固體樣品加入裂解液，95℃裂解10 min，上清液即可作為模板，無(wú)需純化。極大簡(jiǎn)化了樣品制備的步驟，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，也減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)場(chǎng)操作步驟簡(jiǎn)單，高中生訓(xùn)練2 h 即可操作。然而，LAMP 檢測(cè)方法也具有一定的局限性：靶序列要求較長(zhǎng)，低于100 bp 無(wú)法設(shè)計(jì)引物。

5 不同測(cè)定方法的比較

目前，常用的百合病毒檢測(cè)方法雖多，但不同的方法會(huì)因植物病毒和寄主的不同而有不同的效果。雖然電鏡觀察法較直觀，但其需高倍數(shù)的電子顯微鏡，且樣品的制備費(fèi)用昂貴。免疫學(xué)方法較為復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作能力要求較高，且實(shí)驗(yàn)需制備大量的高質(zhì)量的抗血清，成本高，不易廣泛推行。PCR 和LAMP 擴(kuò)增時(shí)引物結(jié)合位點(diǎn)不同，PCR 引物只需與靶序列的上、下游位點(diǎn)結(jié)合且引物不完全匹配時(shí)，PCR 仍能擴(kuò)增出片段，但易出現(xiàn)非特異性片段，而LAMP 4 條引物只有與靶序列的6 個(gè)區(qū)域完全匹配，才能進(jìn)行有效擴(kuò)增。與常規(guī)PCR 和RT－PCR 相比，LAMP 檢測(cè)具有特異性和靈敏度更高、用時(shí)更短。LAMP 只需在等溫條件下完成，用恒溫水浴鍋就可完成反應(yīng)，適合在基層和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，是一項(xiàng)快速、便捷但又準(zhǔn)確性高的新技術(shù)，具有很廣的發(fā)展前景。簡(jiǎn)而言之，自LAMP 技術(shù)發(fā)展以來(lái)，因其操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴儀器設(shè)備、快速、高效、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，更適用于田間樣本檢測(cè)。