色譜法測定甜葉菊葉片及其提取物中甜菊糖總苷含量的研究

羅勇為，鐘曉燕，姚滿芳，吳茜茜，唐林波，易琳捷，張平軍

(1廣東省科學院生物工程研究所，廣東廣州510316；2廣東省綠色制糖工程技術研究中心，廣東廣州510316；3廣西桂林銳德檢測認證技術有限公司，廣西桂林541004；4桂林三金藥業股份有限公司，廣西桂林541200；5廣西糖業集團有限公司，廣西南寧530022)

0 引言

甜葉菊提取物在國際市場上作為一種主要的天然甜味劑，廣泛應用于食品、包裝食品、桌面甜味劑、飲料(包括能量飲料)、膳食補充劑、烘焙產品、奶制品等行業[1-3]。每年全球該產品的銷售額高達幾億美金，市場迅速增長，而且將繼續保持強勁的增長趨勢。隨著消費者對飲料產品和食品的成分含量越來越關注，目前許多消費者也開始避免攝入人工及化學合成甜味劑，減糖仍然是制造商取勝的關鍵所在[4-5]。而天然來源的甜葉菊和接近零熱量的市場定位具有明顯的優勢。2014年，世界衛生組織建議人們將日常糖攝入量減半，以及公眾對一些合成甜味劑的“安全性能”表示擔憂，使天然來源甜味劑甜菊糖的需求不斷攀升。此外，甜葉菊提取物在軟飲料和果汁、冰淇淋以及其他各種產品中的應用日益增加，這歸因于甜葉菊提取物的高甜度天然甜味劑特性。到2025年甜菊糖有望占全球甜味劑市場份額的 15%～20%。全球甜菊糖甜味劑市場依據類型分為液體、粉末和藥片形式。日益增長的肥胖水平加上對糖尿病和心血管疾病的發病風險的關注促使消費者做出更健康的選擇，這有利于創造市場對甜菊糖的需求。由于健康問題，合成或人工甜味劑的天然替代品的需求日益增加，再加上植物來源甜味劑需求的增長等因素，預計將在未來5～10年推動甜菊糖市場的增長[6-10]。

由于粉末甜菊糖的可用性強和使用方便，到2025年該市場份額有望占據整個甜菊糖市場的70%。目前，中國已成為全球最大的甜葉菊生產與出口國，從原料到成品如何更好地滿足國內外市場的質量控制要求，是行業經久不息的關注點。本文從工業生產以及便捷快速檢測的視角初步研究同時測定甜葉菊葉片及其提取物中甜菊糖總苷的方法，有助于提高甜葉菊提取物生產企業的質量控制水平和產品的市場競爭力，促進甜葉菊產業的發展。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

甜葉菊原料來源于黑龍江、新疆、甘肅的甜葉菊種植基地；甜葉菊提取物來源于桂林萊茵生物科技股份有限公司。

標準品：甜菊苷(購自美國 ChromaDex，含量98.53%)、瑞鮑迪苷 A(購自美國 ChromaDex，含量98.85%)；其他7種糖苷標準品：瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷(均購自 ChromaDex)。無水甲醇，AR 500 mL/瓶，西隴化工股份有限公司；乙腈為色譜級；磷酸：AR 500 mL/瓶，西隴化工股份有限公司；水為Milli-Q超純水。

圖1 甜菊糖苷9個成分混合標準品圖譜

1.2 實驗設備與儀器

高效液相色譜儀(型號：1200，美國安捷倫公司)，配備在線真空脫氣機、四元低壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)及Chemstation色譜工作站；電子分析天平(型號：XS205du，感量：0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司)；小型高速離心機(型號：TGL-16B，上海安亭科學儀器廠)；超聲波清洗器(型號：SK-7200H，上?？茖С晝x器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

以十八烷基鍵合硅膠填充柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)或同類型柱；以乙腈-0.1%磷酸水(30∶70，V/V)為流動相；柱溫40℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為210 nm。理論板數按瑞鮑迪苷A峰計算應不低于3000。

2.2 標準品、樣品溶液的制備

2.2.1 混合標準品溶液的制備

分別稱取適量甜菊苷、瑞鮑迪苷 A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷標準品，置于同一個容量瓶中，用30%乙腈水溶液完全溶解后定容，制成每1 mL約含0.04 mg的混合標準品溶液。混合標準品溶液用于確定9種糖苷的相對保留時間。甜菊糖苷9個成分混合標準品圖譜如圖1所示。

2.2.2 標準品溶液的制備

分別取瑞鮑迪苷 A和甜菊苷標準品適量，加30%乙腈水溶液制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得瑞鮑迪苷A和甜菊苷混合標準品溶液，其圖譜見圖2。

2.2.3 甜葉菊葉片樣品溶液的制備

圖2 瑞鮑迪苷A和甜菊苷混合標準品圖譜

檢查甜葉菊原料是否添加甜葉菊梗或其他雜質，進行以下操作。

2.2.3.1 若未含有添加甜葉菊梗或其他雜質

目測無明顯的雜質則直接取約50 g原料打粉，用50 mL容量瓶稱取樣品約2000 mg，加入35～40 mL甲醇浸泡1 h，超聲提取30 min，冷卻至室溫，定容至刻度，搖勻，離心，過0.45 μm濾膜，續濾液轉移至進樣瓶，待測。

2.2.3.2 若含有添加甜葉菊?；蚱渌s質

目測有?；蜉^多雜質的樣品則需取約200 g按四分法分成4份，任取一份原料打粉過100目篩，分別對上、下部分取樣，按2.2.3.1步驟進行樣品溶液的制備；計算上、下部分的加權含量。過篩部分應超過總打粉量的80%。

2.2.4 甜葉菊提取物樣品溶液的制備

取本品粉末約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加30%乙腈水溶液超聲處理，冷卻至室溫，30%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得樣品溶液。其中，甜葉菊原料樣品圖譜和甜葉菊提取物樣品圖譜見表3、表4。

圖3 甜葉菊原料樣品圖譜

2.3.5 測定法

分別精密吸取混合標準品溶液、標準品溶液與樣品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測定。分別對混合標準品溶液、標準品溶液和樣品溶液進行色譜分析。將樣品溶液的色譜圖與混合標準品溶液的色譜圖相比較，以確定樣品溶液色譜圖中各組分對應的峰。記錄樣品溶液色譜圖中甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷 F、杜克苷 A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的峰面積及標準品溶液色譜圖中甜菊苷和瑞鮑迪苷 A的峰面積。

瑞鮑迪苷A含量(以干基計)的質量分數wa按公式⑴計算：

式中：mR-瑞鮑迪苷 A標準溶液中瑞鮑迪苷 A的質量(以干基計)，單位為毫克(mg)；m-樣品溶液中樣品的質量(以干基計)，單位為毫克(mg)；Aa-樣品溶液色譜圖中瑞鮑迪苷A的峰面積值；AR-瑞鮑迪苷A標準溶液色譜圖中瑞鮑迪苷A的峰面積值。

圖4 甜葉菊提取物樣品圖譜

其他8種糖苷含量(以干基計)的質量分數wi按公式⑵計算：

式中：i-s、b、c、d、f、da、ru、sb，分別對應甜菊苷、瑞鮑迪苷 B、瑞鮑迪苷 C、瑞鮑迪苷 D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷；mS-甜菊苷標準溶液中甜菊苷的質量(以干基計)，單位為毫克(mg)；m-樣品溶液中樣品的質量(以干基計)，單位為毫克(mg)；fi-i組分與甜菊苷的式量比值：1.00(甜菊苷)、1.00(瑞鮑迪苷 B)、1.18(瑞鮑迪苷 C)、1.40(瑞鮑迪苷 D)、1.16(瑞鮑迪苷 F)、0.98(杜克苷A)、0.80(甜茶苷)、0.80(甜菊雙糖苷)；Ai-樣品溶液色譜圖中i組分的峰面積值；AS-甜菊苷標準溶液色譜圖中甜菊苷的峰面積值。

由上述公式⑴和⑵計算得到 9種組分的含量wa、ws、wb、wc、wd、wf、wda、wru和wsb，取各組分含量之和即為樣品中甜菊糖苷含量。

3 實驗結果與討論

3.1 色譜系統穩定性試驗

取甜葉菊瑞鮑迪苷A溶液，連續進樣6針；①重復性：6次測試值的峰面積及保留時間的RSD值，以瑞鮑迪苷A計，峰面積的RSD值應不高于1.0%，保留時間的RSD值應不高于2.0%；②以瑞鮑迪苷A對稱因子計，應在0.8～1.5之間；③分離度應不低于 1.5；④理論塔板數，以瑞鮑迪苷 A理論塔板數計，應不低于3000。結果如表1、表2所示。

結果表明：瑞鮑迪苷A的保留時間為11.5 min左右，峰面積的RSD 0.082%，遠低于1.0%，保留時間的RSD 0.35%，低于2.0%，重復性良好；瑞鮑迪苷A對稱因子1.13，在0.8～1.5之間；瑞鮑迪苷A的分離度1.86，高于1.5，主成分與相鄰雜質峰分離良好；瑞鮑迪苷 A理論塔板數 13803，遠高于3000，柱效較高；整體表明檢測方法采用的色譜系統穩定性良好。

3.2 線性分析

表1 重復性試驗結果

表2 色譜系統穩定性試驗結果

瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷標準品溶液曲線的制備：精密稱取瑞鮑迪苷A 49.43 mg，甜菊糖苷50.23 mg，分別置于25 mL容量瓶中，加入乙腈水溶液超聲溶解，放置至室溫，乙腈水定容至刻度，搖勻后做儲備液使用。用移液管移取適量，乙腈水定容至刻度，依次逐級稀釋制備其他5個不同濃度的溶液，將以上制備好的6個不同的標準品溶液各10 μL分別注入HPLC儀，制備瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷標準溶液曲線。結果如表3、表4所示。

結果表明：瑞鮑迪苷 A線性回歸方程：Y=1943.9444X+1.4026，相關系數R2=0.999994；甜菊糖苷線性回歸方程：Y=2330.3740X+3.7848，相關系數R2=0.999990；在0.001～2.0 mg/mL濃度范圍內與瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷峰面積呈良好線性關系。

3.3 穩定性分析

取甜葉菊提取物溶液，間隔一定時間進樣1次，記錄峰面積，結果見表5。

試驗結果表明，不同時間同一甜葉菊提取物溶液進樣，瑞鮑迪苷 A峰面積的相對標準偏差為0.12%，甜菊糖苷峰面積的相對標準偏差為0.18%，均小于2%，甜葉菊樣品溶液在24 h內穩定。

表3 甜葉菊瑞鮑迪苷A曲線的制備

表4 甜葉菊甜菊糖苷曲線的制備

表5 甜葉菊提取物溶液穩定性考察

3.4 準確度驗證

精密稱取甜葉菊提取物9份，以3份為一個濃度，分別加入標準溶液為甜葉菊提取物中瑞鮑迪苷A、甜菊糖苷含量的40%、90%、130%，再加入30%乙腈水超聲溶解，冷卻至室溫，30%乙腈水定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液進行HPLC分析，回收率結果見表6、表7。

結果表明，瑞鮑迪苷A加樣回收的平均回收率為100.32%，相對標準偏差0.47%；甜菊糖苷加樣回收的平均回收率為99.66%，相對標準偏差0.47%；回收率結果均在95%～105%之間，方法有良好的準確度。

3.5 耐用性分析

精密稱取甜葉菊提取物24.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加入30%乙腈水超聲溶解，冷卻至室溫，30%乙腈水定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液進行HPLC分析。取不同品牌的色譜柱、更改色譜柱的溫度、更改流動相流速分別進行樣品含量的測定，測試結果見表8。

試驗結果表明，采用不同品牌的色譜柱，瑞鮑迪苷A含量的相對標準偏差為0.32%，甜菊糖苷峰含量的相對標準偏差為0.85%；更改色譜柱的溫度，瑞鮑迪苷A含量的相對標準偏差為0.19%，甜菊糖苷峰含量的相對標準偏差為 0.36%；改變流動相的流速，瑞鮑迪苷A含量的相對標準偏差為0.21%，甜菊糖苷峰含量的相對標準偏差為 0.28%；上述含量RSD均小于2%，說明本檢測方法在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響，具有較好的耐用性。由試驗可知，當采用綠百草-C18，1.0 mL/min的流速，色譜柱溫度40℃時目標峰峰型尖銳，主成分與相鄰雜質峰分離良好，柱效較高，條件最優。

表6 甜葉菊瑞鮑迪苷A回收率試驗結果

表7 甜葉菊甜菊糖苷回收率試驗結果

表8 耐用性試驗結果匯總

3.6 甜葉菊原料雜質的影響

基于行業現狀，市場上銷售的甜葉菊原料大多含有不同程度的小石子、土、甜葉菊梗莖等雜質，為了避免因含雜質太高原料品質變差而導致需要改進工藝，從而提高生產成本，業內提出雙12%標準：雜質占比不超過12%，原料總苷含量不低于12%。為了提高檢測甜葉菊原料的效率并避免雜質對結果的影響，取不含雜質的甜葉菊加入不同的雜質量進行測試。試驗結果見表9。

結果表明，不同的雜質添加量與過篩部分含量呈正相關，當過100目篩部占總打粉重量的80%時，較為接近業內的雙12%標準。所以過100目篩部分的甜葉菊原料應超過總打粉重量的 80%；同時，對于雜質較多的樣品，為了消除雜質對甜葉菊含量的干擾，可通過對 100目篩上(通過 100目篩樣品)、篩下(未通過 100目篩樣品)部分的樣品粉末分別檢測，計算加權含量。

4 討論與結論

表9 甜葉菊原料中雜質與過篩部分總苷的關系

本方法采用甜葉菊原料打粉過100目篩部分的 應超過總打粉重量的 80%，通過計算上、下部分的加權含量能確保消除雜質對原料的干擾，大大縮短甜葉菊原料的制樣時間的同時保證結果的準確性。色譜條件選擇綠百草-C18，乙腈：0.1%磷酸水洗脫，流動相無需使用緩沖鹽體系，任一實驗室均簡便易配且能延長色譜柱的使用壽命，有著良好的分離度和較高的柱效，色譜柱的分離度和使用壽命優于甜菊糖苷國標方法和文獻所述氨基柱方法[11]。加樣回收的瑞鮑迪苷 A和甜菊苷的平均回收率分別為99.66%、100.32%；相對標準偏差0.47%，滿足食品理化檢測中檢測方法確認的技術要求中關于回收率參考范圍95%～105%的規定，表明該法有良好的準確度，符合方法驗證要求。校準曲線濃度范圍覆蓋3個數量級，相關系數不低于 0.99，表明該法具有較好的線性范圍，符合方法驗證要求。本方法的重現性、穩定性相對標準偏差均小于2%，滿足方法驗證的要求。本方法在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響，具有較好的耐用性。本方法目標峰能與相鄰的雜質有效分離，分離度及純度因子滿足要求，具有良好的專屬性。

甜菊糖苷RP-HPLC分析方法的驗證結果表明，該分析方法有良好的精密度和較高的準確度，線性范圍符合要求，能夠準確、快速、有效地檢測出甜葉菊葉片及提取物中甜菊糖總苷的含量，控制各環節產品的質量。