黃芪多糖治療對去卵巢誘導骨質疏松大鼠骨密度、骨量和骨代謝的影響

張小鈺 陳慧 馬敬祖 馬志榮 汪玉海*

1.西北民族大學第一附屬醫院(寧夏回族自治區人民醫院)，寧夏 銀川 750012 2.解放軍聯勤保障部隊940醫院，甘肅 蘭州 730050

絕經后骨質疏松癥是一種常見的骨病，其特征是骨量降低和骨微結構破壞，導致骨脆弱性增加和骨折風險升高[1-2]。絕經后骨質疏松癥已經成為一種日益重要的健康問題，給全世界數百萬人的家庭和本人帶來了嚴重的影響[3]。目前，治療這類骨質疏松癥最常用的藥物包括二膦酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑、甲狀旁腺激素(1～34)、RANK配體抑制劑和性激素[4]。然而，這些藥物的臨床療效受到藥物耐受性較差和長期不良副作用的影響[5]，因此急需新的藥物來改善這類情況。黃芪多糖(astragalus polysaccharide，ASNT)是從中藥黃芪中提取、分離，純化所得主要有效活性成分，具有刺激骨髓造血和增強免疫功能的作用；近年來有研究指出ASNT能減輕絕經后骨質疏松癥的癥狀，但治療機理尚不清楚[6-7]。本研究的目的是研究黃芪多糖對雙側去卵巢手術誘導大鼠骨質疏松模型骨密度和骨量的影響，并探索獲得這種療效的可能機制。

1 資料和方法

1.1 動物模型的建立和治療

6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠購買于上海實驗動物中心，并飼養在12 h光暗循環，溫度控制在(22±2)℃和濕度控制在50%～60%的環境中。所有大鼠能自由接觸到實驗室提供的標準嚙齒動物食物和水。在實驗之前所有大鼠適應性飼養7 d。隨后對大鼠進行背側雙側去卵巢術(OVX)或假手術(Sham)，并將大鼠正常條件下飼養12周以達到成功構建骨質疏松癥模型；隨機選擇10只OVX及Sham大鼠(每組5只大鼠)，通過測試骨密度(bone mineral density，BMD)驗證成功建模。然后將大鼠分成3組，每組10只。CON組：Sham大鼠+生理鹽水。OVX組：OVX大鼠+生理鹽水；ASNT組：OVX大鼠給予400 mg/(kg·d)黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，國藥準字220040086，藥物融入生理鹽水)灌胃治療，藥物劑量參考[8]。藥物治療12周后取出左股骨，用10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，進行BMD微型計算機斷層掃描檢查(Micro-CT)。將右股骨切片并在液氮中冷凍以用于Western印跡(WB)分析。所有實驗方案均經醫院倫理委員會批準(No.2019016)。

1.2 血清測定中骨代謝指標

給藥12周后稱重每組動物，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，并從腹腔動脈取血以測量血清中雌二醇(E2)、鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)水平。使用原子吸收光譜儀檢測大鼠的血清鈣和雌二醇的水平；血清骨轉換標志物包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)使用酶聯免疫吸附法檢測，試劑盒由北京中肽生物科技有限責任公司提供。

1.3 骨密度測量

在10%中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，左側股骨用生理鹽水沖洗2 h。骨密度使用專門的小動物高分辨率骨密度儀(Discovery A/SL/W/C；HOLOGY，Bedford，MA，01730 USA)通過雙能量X射線吸收測量法測量大鼠股骨骨密度。

1.4 Micro-CT檢查

在骨密度測量后，左側股骨通過錐束臺式微型CT測量(μCT80，Sanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)，并通過相關分析軟件(μCT80 Evaluation Program v6.51，Sanco Medical，Switzerland)進行評估。掃描后選擇股骨遠端高于生長板1 mm的松質骨作為VOI，該VOI僅限于股骨內部區域，其中通過使用CT分析器軟件繪制自由形式等高線來提取小梁和皮質骨。使用標準化技術勾勒松質骨的微觀結構，通過多平面重組獲得三維(3D)圖像；以確定骨體積分數(BV/TV，%)、表面積體積分數(BS/TV，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)、骨小梁數目(Tb.N，mm-1)和骨小梁間隙(Tb.Sp，μm)。

1.5 WB檢測

左側股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒定量測定蛋白濃度。將蛋白與加載緩沖液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其變性。用10%和15%SDS-PAGE分離50 μg總蛋白，轉移到0.45 m聚偏氟乙烯(PVDF)膜中。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，將膜分別和BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5一抗在4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL試劑(美國Thermo Scientific)顯影印跡。使用GAPDH蛋白進行歸一化。用Image J軟件測量各蛋白條帶的總和密度。

1.6 統計學分析

實驗數據表示為均數±標準差。統計分析用SPSS 22.0軟件進行。基于方差結果的同質性檢驗，使用Student’st檢驗比較兩個不同組間差異。P<0.05判斷差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度和骨代謝指標分析

各組大鼠之間的平均BMD結果如表1所示。CON組和OVX組比較時發現OVX組股骨BMD值和E2、Ca水平較CON組顯著降低(P<0.05)；而ASNT組BMD和Ca、E2水平較OVX組明顯升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)。和CON組比較，OVX組ALP和OC顯著升高(P<0.05)；而ASNT組ALP和OC水平較OVX組明顯降低，比較差異有統計學意義(P<0.05)。這些結果表明ASNT能提高去卵巢大鼠骨密度和降低骨轉換速度。

表1 各組大鼠之間的平均BMD值結果Table 1 Mean BMD values results in the

2.2 ASNT對OVX大鼠股骨干骺端骨微結構的影響

大鼠股骨干骺端骨小梁三維重建如圖1所示；骨微結構參數包括BV/TV、BS/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp，如圖2所示。與CON組相比，OVX組大鼠BV/TV(P=0.043)、BS/TV(P=0.000)、Tb.Th(P=0.002)和Tb.N(P=0.033)的水平顯著下降，而Tb.Sp(P=0.000)顯著增加。ASNT組的Tb.Sp水平顯著下降，而其他參數明顯增加(和OVX組比較，BV/TV：P=0.024；BS/TV：P=0.002；Tb.Th：P=0.000；Tb.N：P=0.025；Tb.Sp：P=0.000)。

圖1 ASNT骨質疏松大鼠股骨三維重建顯微CT圖像的影響Fig.1 Assessment of the effect of ASNT on the femur of the osteoporosis rats in 3D-reconstructed micro-CT images

圖2 ASNT對骨質疏松大鼠微結構參數的影響Fig.2 Assessment of ASNT effect on micro-architectural parameters in osteoporosis rat model注：和CON組比較，**P<0.05，*P<0.01；和OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 ASNT增強OVX大鼠中的BMP-2/Smads信號傳導和骨形成

BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5的蛋白表達如圖3所示，OVX組大鼠BMP-2(P=0.000)、Smad1(P=0.009)、p-Smad1(P=0.000)、p-Smad5(P=0.009)的蛋白質表達水平顯著下調。而ASNT治療能有效上調BMP-2(P=0.000)、p-Smad1(P=0.000)和p-Smad5(P=0.025)的表達水平。

圖3 Western blot分析BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5蛋白的表達Fig.3 Western blotting analysis of protein expressions of BMP-2, Smad1, p-Smad1, Smad5, and p-Smad5注：和CON組比較，**P<0.05，*P<0.01；和OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

絕經后骨質疏松癥的形成是一個長期的病理過程。骨密度和骨小梁微觀結構變化可以反映出骨量的細微變化[9]。血清中的骨代謝指標可以反映骨代謝的狀態，因此可以作為評價藥物療效的另一標準[10]。黃芪多糖在以往的研究已經表現出促進成骨和改善骨髓間充質干細胞成骨分化的效果[11-12]。因此，本實驗以骨密度、血清骨代謝指標和骨微觀結果變化為主要指標研究黃氏多糖對取卵巢大鼠治療的效果。

絕經后雌激素水平降低，并且T細胞被激活以促進破骨細胞形成[13]。血清中的OC可以表明新形成的成骨細胞處于活躍狀態，而ALP是骨形成和骨轉換的重要生化指標。血清中的OC水平可以表明新形成的成骨細胞處于活躍狀態，而ALP是骨形成和骨轉換的重要生化指標[14]。實驗結果表明，模型組血清E2明顯降低，而OC水平顯著升高，表明成功建立了高轉化性骨質疏松癥模型，與絕經后骨質疏松癥的臨床特征相符[15]。黃芪多糖可以顯著增加大鼠血清中E2、ALP和OC的水平，表明黃芪多糖具有雌激素樣作用，并且可以通過降低血清中的ALP和OC來預防卵巢切除術后骨質疏松的形成。本研究進一步對股骨遠端進行Micro-CT掃描發現去卵巢術后12周，OVX組大鼠的BV/TV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N明顯降低，而Tb.Sp明顯升高。在本研究中，ASNT治療12周后，BV/TV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N與OVX大鼠相比顯著升高。相反，ASNT組大鼠股骨遠端Tb.Sp與OVX組相比明顯降低。因此，本研究表明ASNT可以改善股骨的BMD和骨微結構特性，和之前研究得出相似的結果[11-12]。

低BMP-2表達與低BMD和骨折高風險密切相關[16]。由于BMP-2可以通過激活I型激活素受體樣激酶和II型跨膜絲氨酸蘇氨酸Ki-Nase受體的異源四聚體復合物發揮作用，后者隨后磷酸化并激活受體調控因子Smad1、5、8；而磷酸化的Smad1、5、8因子與Smad4結合并轉移到細胞核中以介導成骨相關基因的表達[17]。在本研究中，卵巢切除可以在蛋白質水平上顯著下調BMP-2 和Smad1、p-Smad1和p-Smad5因子的表達。ASNT治療可以顯著逆轉OVX大鼠這些蛋白質表達的變化，明顯上調BMP-2 和Smad1、p-Smad1和p-Smad5的表達；上述結果表明ASNT治療可以刺激BMP-2/Smads信號通路的激活。

本研究有其不足之處，首先研究模型限制了研究結果進一步推廣；其次劑量選取的原因只能證實本研究選取的劑量對去卵巢引起骨量流失保護作用，是否合適其他類型的骨質疏松癥就不得而知了；由于沒有進一步研究該藥物對細胞的影響，因此需要進一步進行體外研究驗證其對成骨細胞和破骨細胞的影響。

本研究的結果表明黃芪多糖對BMD的積極影響，同時也發現它對骨微結構具有顯著的積極保護作用。另外，黃芪多糖治療后BMP-2/Smads信號通路的激活。總之，黃芪多糖可以作為治療絕經后骨質疏松癥的有潛力治療藥物之一，治療效果可歸因于BMP-2/Smads信號通路的激活，具體效果如何還需要進一步進行相關實驗。