阿司匹林聯合雷奈酸鍶治療對成骨細胞以及去卵巢大鼠骨密度和骨量的影響

周皖舒 陶周善 顧長斌*

1.皖南醫學院第二附屬醫院老年醫學科，安徽 蕪湖 241000 2.皖南醫學院第一附屬醫院(弋磯山醫院)創傷骨科，安徽 蕪湖 241000

骨質疏松癥是一種與年齡相關的全身性疾病，以進行性骨量丟失、骨強度降低和骨折風險增加為特征[1]。絕經后的婦女特別容易受到這種骨代謝紊亂的影響。在育齡期間，雌激素通過刺激成骨細胞活動來幫助維持女性的骨量。絕經后婦女雌激素水平降低導致成骨細胞骨形成速率降低，導致骨吸收凈增加[2]。此外，絕經后婦女成骨細胞增殖減少，導致破骨細胞分化增強和過度活躍，進而骨質丟失。有學者報道阿司匹林(aspirin，ASP)[3]可能具有抑制骨吸收作用，隨后的流行病學報告還發現，經常使用小劑量的ASP或其他非甾體抗炎藥經常與骨密度增加相關[4]。已經有基礎研究報道ASP具有保護去卵巢大鼠骨量和骨密度的作用[5]。雷奈酸鍶(strontium ranelate，SR)是雷尼酸的一種鍶鹽，目前正被用作治療骨質疏松癥的抗吸收藥物。鍶在骨重建中起著特殊的作用，鍶通過抑制破骨細胞活性減少骨吸收，通過刺激成骨細胞活性促進骨形成[6-7]。鑒于阿司匹林和雷奈酸鍶均有抗骨質疏松癥的效果，本研究觀察阿司匹林聯合雷奈酸鍶使用對成骨細胞以及對去卵巢大鼠骨量和骨密度的影響，兩者聯合治療骨質疏松癥的可行性。

1 資料和方法

1.1 細胞培養和成骨細胞實驗

來源于新生小鼠顱骨的MC3T3-E1細胞購自中國科學院(上海)典型培養委員會細胞庫， α-MEM培養基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%鏈霉素青霉素(100 U/mL)。將MC3T3-E1細胞接種于成骨分化培養基中，24 h后不加入任何藥物(Con組)，或者分別加入5 mmol/L的SR(SR組)、加入2 mmol/L的ASP(ASP 組)及同時加入5 mmol/L的SR和2 mmol/L的ASP(SR+ASP組)，共培養14 d后，用4%多聚甲醛固定15 min，用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(Beyotime，中國上海)進行堿性磷酸酶染色。堿性磷酸酶檢測試劑盒(Beyotime，中國，上海)根據制造商的說明測定ALP活性，并用微量分光光度計在405 nm處讀出活性量。茜素紅S染色30 min，對礦化結節進行可視化。為了定量評價，本研究用10%的十六烷基氯化吡啶去細胞15 min，上清液在540 nm處讀數。

1.2 去卵巢模型建立和指標檢測

3個月大的雌性SD大鼠從弋磯山醫院中心實驗室獲取，并在控制溫度(22℃～24℃)和濕度(50%～60%)的條件下，保持12 h明暗周期。自由獲取標準實驗室嚙齒動物飲食和水。實驗前所有大鼠適應性飼養7 d。根據FDA指南對動物進行背側雙側切除卵巢手術OVX或假手術。12周后，隨機選擇20只大鼠(每組10只)以通過測試骨密度(BMD)驗證成功的建模。然后將大鼠分為4組，每組10只：OVX(OVX大鼠+生理鹽水)，ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)]，SR[OVX+SR，300 mg/(kg·d)]，SR+ASP[OVX+ASP，9 mg/(kg·d)+SR，300 mg/(kg·d)]。大鼠的ASP或SR的劑量參考發表的文獻[8-9]。治療12周后，取出左股骨，在10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，隨后進行Micro-CT檢查和組織切片HE染色檢測。將右股骨切片并在液氮中冷凍，用于蛋白質印跡(WB)分析。

Micro-CT檢查：左股骨通過錐形束臺式Micro-CT(μCT80，Scanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)測量，并通過相關分析軟件進行評估(μCT80 Evaluation Program v6.5 1，Scanco Medical，Switzerland)。掃描后，選擇生長板上方1 mm處股骨遠端的松質骨作為VOI，將其限制在股骨內部區域，通過CT分析儀軟件繪制自由形狀的輪廓來提取骨小梁和皮質骨。使用標準化技術表征松質骨的微結構，以確定相對骨體積(BV/TV，%)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)，骨小梁數目(Tb.N，1/mm)，骨小梁分離度(Tb.Sp，mm)和骨密度(BMD，g/cm2)；通過多平面重整獲得三維(3D)圖像。

隨后左股骨進行病理學檢測，用乙二胺四乙酸溶液(EDTA)(Servicebio，G1105)將固定的左股骨脫鈣4～6周。樣品用標準分級的酒精溶液脫水并包埋在石蠟中。將石蠟中的骨組織縱向切成4 μm的薄片。載玻片用于蘇木精和曙紅(HE)染色。

接下來對右側股骨進行蛋白印跡(western blot，WB)檢測，在液氮中粉碎后用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。通過BCA蛋白質試劑盒定量測量蛋白質的濃度。將蛋白質與上樣緩沖液混合，并在100℃下煮沸5 min以使其變性。 將50 μg總蛋白通過10%和15%SDS-PAGE分離，并轉移到0.45 m的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜中。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜分別與購于Abcam的Notch 1、CBF 1和Jagged 1一抗在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與綴有辣根過氧化物的二抗一起孵育1 h。印跡用ECL試劑(Thermo Scientific，美國)顯影。β-actin蛋白用于標準化。通過Image J軟件測量每個蛋白條帶的總密度。

圖1 每組大鼠中ALP和茜素紅染色以及平均光密度Fig.1 Average optical density of ALP and Alizarin red staining in each group

1.3 統計學分析

所有數據均以均數±標準差(SD)表示，使用Leven檢驗方差的同質性。通過單向方差分析(ANOVA)和最小顯著差異(LSD)檢驗確定特定組之間的差異。P<0.05表示差異有統計學意義。所有數據均使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 ALP染色和茜素紅染色結果分析

如圖1所示，ALP陽性細胞染色后呈藍紫色，其中以SR+ASP組ALP陽性細胞最多。茜素紅陽性細胞染色后呈紅色，其中以SR+ASP組茜素紅陽性細胞最多。根據ALP和茜素紅染色的平均光密度的統計分析(圖1)，SR+ASP組的ALP陽性細胞和茜素紅陽性細胞的平均光密度與SR組和ASP組相比明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；SR組和ASP組之間，ALP陽性細胞和茜素紅陽性細胞的平均光密度也發現有顯著差異(P<0.05)。結果表明SR+ASP組成骨細胞活性和礦化功能更強。

2.2 Micro-CT分析

Micro-CT更好地顯示了股骨干骺端骨小梁的總體改變情況，骨小梁的微觀參數如圖2所示。ASP組、SR組、SR+ASP組左側股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較OVX組明顯升高，而Tb.Sp較OVX組明顯降低 (P<0.05)；而SR+ASP組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較ASP組和SR組明顯升高，而Tb.Sp較ASP組和SR組明顯降低(P均<0.05)。

2.3 大鼠組織學變化

HE結果表明，SR聯合ASP治療能更好地保護去卵巢大鼠骨量的流失。如圖3所示，與OVX組相比，ASP、SR及SR+ASP組的大鼠骨小梁數量和密度得到明顯的改善，而在SR+ASP組表現的最為明顯。

圖2 4組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果Fig.2 Results of micro-CT in the femoral metaphysis of rats in the four groups注： OVX組(a)、ASP組(b)、SR組(c)及SR+ASP組(d)；與OVX組相比，*P<0.05；與ASP組相比，#P<0.05；與SR組相比，&P<0.05。

圖3 4組大鼠股骨干骺端HE切片檢測結果Fig.3 Results of HE slices in the femoral metaphysis of rats in the four groups注：OVX組(A)、ASP組(B)、SR組(C)及SR+ASP組(D)(×20)。

2.4 Notch信號通路改變

和OVX組比較，ASP組、SR組及SR+ASP組的大鼠Notch信號通路被激活；Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達上調，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。和ASP組和SR組比較，SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達水平顯著升高，差異比較有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 使用WB檢測Notch 1、CBF 1和Jagged 1和β-actin的相對表達Fig.4 Relative expression of Notch 1, CBF 1, and Jagged 1 to β-actin using Western blotting注：與OVX組相比，*P<0.05；與ASP組相比，#P<0.05；與SR組相比，&P<0.05。

3 討論

以前有報道稱，一旦雌性大鼠被切除卵巢，觀察到的骨質疏松癥的主要表現是破骨細胞數量增加，溶骨作用增強和高骨轉換，骨吸收超過骨形成。在人類絕經后骨質疏松癥中觀察到的骨代謝變化與卵巢切除(OVX)大鼠的骨代謝變化之間有許多相似之處，因此，OVX大鼠被認為是絕經后婦女骨質疏松癥的有效動物模型[10]。因此本研究選取去卵巢大鼠作為研究模型探討使用SR和ASP聯合療法防治雌激素缺乏大鼠的骨質流失。OVX大鼠用SR和ASP聯合治療12周。Micro-CT和HE染色切片結果顯示，SR組和ASP組股骨骨密度較OVX組明顯增加，骨小梁的結構得到了顯著改善；而SR+ASP組骨密度以及骨小梁微觀結構較SR組和ASP組均勻明顯改善。

本研究發現SR+ASP組取得較好的療效可能和每種藥物單獨作用機制有關。以前的研究表明ASP通過作用于Fas/FasL信號通路，抑制T淋巴細胞對骨髓間充質細胞的凋亡作用，促進成骨分化，抑制破骨細胞分化，從而干預骨壞死的發生發展[3，11]。另外，環氧合酶-2(COX-2)可能通過改變基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)和白細胞介素(IL)-6(21)的表達來促進骨吸收。ASP是COX-2的有效抑制劑，也可能降低COX-2，從而抑制骨質疏松時骨吸收的發展[12]。SR是為數不多的針對骨質疏松的藥物之一，它既能刺激成骨細胞，從而促進骨形成，又能抑制破骨細胞(減少骨吸收)[6-7]，從而減少脊椎和非脊椎骨折[13]。由于SR和ASP均具有促進成骨和抑制破骨作用，SR+ASP組取得較好的療效可能和兩者作用機制疊加有關。

在哺乳動物中，Notch家族有4個受體Notch1-4和5個受體結合配體Jagged1/2和δ樣1/3/4[14]。當同源配體與Notch受體結合時，Notch信號被激活，導致γ分泌酶的一系列蛋白水解和Notch胞內信號的釋放[15]。先前的研究表明，Notch信號通路是骨形成的調節因子，Notch信號激活可以促進成骨細胞的分化和礦化[16]。由于Notch信號通路在骨形成中的重要作用，本研究進一步探索了各組大鼠骨組織中Notch信號通路改變，結果發現，較Con組，ASP組、SR組以及SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達明顯上調，而SR+ASP組Notch 1、CBF 1和Jagged 1表達上調最為顯著，這表明SR聯合ASP治療可能通過激活Notch信號通路來實現；由于Notch信號通路對成骨細胞分化及增殖的重要作用，因此可以解釋SR+ASP組更高的骨量和骨密度，說明兩者聯合使用對骨形成刺激作用更強。

總的來說，本研究初步使用雷奈酸鍶聯合阿司匹林干預去卵巢誘導骨質疏松癥，結果表明聯合使用較單獨使用效果更佳，而這種療效可能通過Notch信號通路介導。由于本研究使用的模型以及樣本量有限，因此有必要進一步探索這種治療方案的優勢；而且本研究選取藥物劑量也是參考文獻，是否是最佳劑量還需要進一步研究。