芝麻素通過(guò)Wnt/β-catenin通路調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用研究

馬忠平 楊云 張志峰 葉楠 楊毅峰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030

骨質(zhì)疏松被定義為以骨骼強(qiáng)度降低、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的一類骨骼疾病。骨質(zhì)疏松通常伴有輕微癥狀或無(wú)癥狀，是臨床病理性骨折的常見(jiàn)原因，也是影響人類健康的高危因素之一[1]。相關(guān)研究報(bào)道，世界范圍內(nèi)骨質(zhì)疏松的發(fā)病率在超過(guò)50歲人群中為15%，在80歲以上的人群中為70%[2-3]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率具有性別特異性：與男性相比，女性的發(fā)病率更高[4]，2%～8%的男性和9%～38%的女性受到來(lái)自骨質(zhì)疏松的不同程度的影響[5]。研究指出，美國(guó)近1 000萬(wàn)人患有骨質(zhì)疏松，超過(guò)1 800萬(wàn)人骨量低[6]。而據(jù)國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)預(yù)測(cè)，至2050年將有超過(guò)50%的骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生在東亞和東南亞[7]。且由于絕經(jīng)后雌激素水平降低對(duì)骨量的影響，老年婦女中骨質(zhì)疏松的發(fā)病率將快速且持續(xù)上升[8]。

骨髓是人體的主要造血器官，由骨髓造血干細(xì)胞、骨髓脂肪組織和基質(zhì)細(xì)胞組成[9]。成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化而來(lái)，在骨形成中具有重要作用。研究指出，與正常人相比，骨質(zhì)疏松患者成骨分化低于正常，由此可知成骨細(xì)胞分化水平與骨質(zhì)疏松病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展與演變密切相關(guān)[10]。Wnt/β-catenin是常見(jiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與控制條件多種生物現(xiàn)象[11-12]。成骨細(xì)胞分化已被證實(shí)受Wnt/β-catenin途徑的調(diào)節(jié)[13-15]。研究指出，成骨細(xì)胞的分化過(guò)程中同時(shí)受到一系列蛋白調(diào)節(jié)，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(osterix，OSX)、SRY-box 9(SOX9)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(recombinant runt related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)[12]。目前未見(jiàn)研究報(bào)道并探討成骨細(xì)胞分化過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路與相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的相互關(guān)系。

芝麻油常用于膳食中的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充[16-17]。芝麻素是一種從花椒植物中分離而來(lái)的木脂素，是芝麻油中的一種常見(jiàn)成分(約含0.25%)。天然芝麻素為右旋體，芝麻素亦可人工化學(xué)合成。Orawan等[18]證實(shí)芝麻素可以通過(guò)激活p38-ERK(extracellular signal-regulated kinases)/MAPK(mitogen-activated protein kinase)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn)人類胎兒成骨細(xì)胞增殖以及人類脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成骨分化。由此可知，芝麻素與成骨細(xì)胞分化密切相關(guān)，在骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療中可能發(fā)揮重要作用，然而，芝麻油作用于BMSCs進(jìn)而影響骨形成的具體機(jī)制尚不十分清楚，其對(duì)骨質(zhì)疏松的作用影響也鮮有研究。

本研究應(yīng)用芝麻素干預(yù)大鼠股骨分離的BMSCs，在沉默Wnt/β-catenin或不沉默Wnt/β-catenin的情況下檢測(cè)BMSCs的成骨分化，進(jìn)而分析芝麻素對(duì)骨質(zhì)疏松的作用。

1 材料和方法

1.1 芝麻素制備

芝麻素(S9314；Sigma-Aldrich LLC.，USA)使用二甲基亞砜(DMSO；Sigma)溶解為14.22 mmol/L的溶液，并儲(chǔ)存于-20℃。

1.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷劑制備

FH535(Sigma)溶解于濃度為10 mmol/L的二甲基亞砜(sigma)中，保存在-2℃。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

SD大鼠(4周齡)購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則指南”(NIP出版物85-23，1996年修訂)進(jìn)行，并經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(項(xiàng)目編號(hào)為2017032，日期為2017年7月15日)。

由大鼠股骨分離BMSCs，將大鼠股骨與周圍軟組織分離并取出。使用a-Minimum Essential培養(yǎng)基(a-MEM；Thermo Fisher Scientific，Ltd，上海，中國(guó))洗滌骨髓。將骨髓切片，用含有10%胎牛血清(FBS；Thermo)、100 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素(Sigma)的α-MEM培養(yǎng)。去除未貼壁的細(xì)胞，貼壁的BMSCs用于培養(yǎng)和擴(kuò)增以及進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)匯合率接近90%時(shí)，貼壁的BMSCs傳代。之后將2～4代BMSCs用于研究實(shí)驗(yàn)。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

BMSCs種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔(康寧公司，上海，中國(guó))。經(jīng)含10%胎牛血清、50 μmol/L抗壞血酸(Sigma)、0.1 μmol/L DMSO和10 mmol/Lb-甘油磷酸酯(Sigma)的α-MEM誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化7 d。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性以及ALP表達(dá)

BMSCs種植于96細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為3×103細(xì)胞/孔。24 h后，用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3 d，以0.1%二甲基亞砜作為陰性對(duì)照(NC)。使用Caspase-8比色分析試劑盒(Abcam PLC.，上海，中國(guó))進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。在450 nm處測(cè)量光密度(OD)值。

BMSCs由NBT-BCIP?溶液(Sigma)染色，用于檢測(cè)成骨細(xì)胞BMSCs中的堿性磷酸酶(ALP)。

1.6 免疫組織化檢測(cè)Osterix(OSX)表達(dá)

BMSCs成骨分化后，以1×105細(xì)胞/孔的密度接種于帶蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。24 h后，應(yīng)用芝麻素(0 μmol/L、1 μmol/L或10 μmol/L)處理細(xì)胞3 d。之后細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛(碧云天生物科技有限公司，上海，中國(guó))在25 ℃下固定30 min。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(碧云天)洗滌細(xì)胞， 25 ℃下振蕩10 min，之后使用3%的H2O2/甲醇(博士德生物技術(shù)有限公司，武漢，中國(guó))于25 ℃下孵育20 min，后使用山羊血清(索萊寶科技有限公司，北京，中國(guó))在25℃下阻斷30 min。然后與兔抗SP7/osterix(OSX)抗體(1∶100)(ab22552，abcam)在4 ℃的濕盒中孵育過(guò)夜。使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，后與山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶100)(7071，Cell Signal Technology，Inc.，上海，中國(guó))于25 ℃孵育30 min。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(ZSGB-BIO，北京，中國(guó))和蘇木精(碧云天)染色后，使用樹(shù)脂(索萊寶)密封載玻片并使用顯微鏡(BX43；Olympus Optical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)觀察。

1.7 免疫熒光檢測(cè)SRY-box9(SOX9)表達(dá)

BMSCs成骨分化后，將1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，蓋蓋玻片。24 h后使用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理細(xì)胞3 d。細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛于25 ℃固定30 min。之后將細(xì)胞懸浮于PBS中并用30 mmol/L甘氨酸(Sigma)于25 ℃下淬火5 min，后經(jīng)0.5%Triton-X(索萊寶)于25 ℃下滲透5 min，使用5%脫脂牛奶和2%牛血清白蛋白(BSA)(Gen-View Scientific Inc.，USA)在25 ℃下封閉1 h。應(yīng)用Sox9兔單克隆抗體(1∶100；#82630，Cell signal Technology，Inc.)于25℃的濕盒中孵育細(xì)胞24 h。后使用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，并與Fluor?594山羊抗兔(1∶500；ZSGB-BIO)在25 ℃黑暗中孵育1 h。細(xì)胞經(jīng)4’6-二胺基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI；Sigma)染色，由共聚焦激光掃描顯微鏡(FV1000，OLYMPUS)觀察。使用Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)分析結(jié)果。

1.8 Western blot檢測(cè)RUNX2、OCN以及Wnt/β-catenin通路相關(guān)抗原表達(dá)

成骨細(xì)胞分化后，將1×105細(xì)胞/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，后在有或無(wú)FH535(1 μmol/L)的情況下用芝麻素(0、1或10 μmol/L)處理3 d。收集細(xì)胞并使用皮爾斯TM細(xì)胞裂解液于4 ℃下裂解20 min后提取蛋白質(zhì)。用10%的分離凝膠和5%的濃縮凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merch Milliporal Corporation)上。使用5%的脫脂牛奶在25 ℃下封閉2 h，后與小鼠抗RUNX2抗體(1∶5000；ab76956，abcam)，小鼠抗骨鈣素(OCN)抗體(1∶3000；ab13420，abcam)，小鼠抗b-actin抗體(1∶5000；abcam)孵育；ab8226，abcam)，兔抗低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)抗體(1∶1000；ab38311，abcam)，小鼠抗糖原合成酶激酶-3b(gsk-3b)抗體(1∶2000；ab93926，abcam)，兔抗b-連環(huán)蛋白抗體(1∶5000；ab32572，abcam)分別孵育24 h。加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶3000；Jackson Immuno Research Laboratory，Inc.，USA)，并在25 ℃下孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用GraphPad“PRISM”軟件(版本5.0；GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)分析數(shù)據(jù)。單因素方差分析(ANOVA)或t檢驗(yàn)用于分析多組或兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芝麻素對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響且無(wú)細(xì)胞毒性

BMSCs成骨分化后用芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以0.1%二甲基亞砜處理后作為正常對(duì)照(NC)組。圖1 A顯示NC組、芝麻素(1 μmol/L)組和芝麻素(10 μmol/L)組之間的OD值，無(wú)顯著差異(F=0.0683，P=0.9343)。以上結(jié)果表明芝麻素對(duì)BMSCs無(wú)有細(xì)胞增殖及毒性作用。

2.2 芝麻素通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs成骨分化

圖1B顯示了芝麻素在沒(méi)有FH535(1 μmol/L)沉默的情況下對(duì)RUNX2(F=113.7，P<0.0001)和OCN(F=89.29，P<0.0001)的顯著促進(jìn)作用。高濃度芝麻素可顯著增強(qiáng)RUNX2和OCN的表達(dá)(P<0.05)。FH535沉默后，芝麻素對(duì)RUNX2和OCN的促進(jìn)作用均減弱。雖然其表達(dá)增加，但與NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1C顯示在沒(méi)有FH535(1 μmol/L)沉默的情況下，芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)對(duì)Wnt/β-catenin通路有顯著的促進(jìn)作用，表現(xiàn)為β-catenin(F=128.60，P<0.0001)和LRP5(F=191.3，P<0.0001)的顯著增加以及gsk-3b的顯著減少(F=69.54，P<0.0001)。較高濃度的芝麻素可進(jìn)一步促進(jìn)Wnt/β-catenin通路活性(P<0.05)。FH535(1 μmol/L)沉默后，Wnt/β-catenin活性受到抑制，芝麻素的干預(yù)對(duì)β-catenin、LRP5或gsk-3b的表達(dá)水平的影響無(wú)顯著性。

圖2顯示了芝麻素對(duì)ALP(圖2 A)(F=23.81，P<0.0001)、OSX(圖2B)(F=73.65，P<0.0001)和SOX9(圖2C)(F=139.1，P<0.0001)的顯著促進(jìn)作用。隨著芝麻素濃度的升高，對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

圖1 A：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后所得的CCK8吸光度；B：阻斷通路與未阻斷通路狀態(tài)下，各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后RUNX2和OCN的WB表達(dá)；C：阻斷通路與未阻斷通路狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的WB表達(dá)Fig.1 A: CCK8 absorbance of bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at various concentrations; B: Expression of RUNX2 and OCN after treatment of bone marrow mesenchymal stem cells with sesamin at different concentrations in the blocked and unblocked pathways; C: WB expression of Wnt/b-catenin pathway-related proteins in bone marrow mesenchymal stem cells under blocked and unblocked pathways.注：NC組：陰性對(duì)照組，0.1%二甲亞砜處理；1組：1 μmol/L芝麻素處理；10組：10 μmol/L芝麻素處理；與NC組比較，*P<0.05；與NC組和1組比較，#P<0.05；與NC+FH535組比較，**P>0.05。

圖2 A：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后ALP的染色表達(dá)；B：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后OSX的免疫組化表達(dá)；C：各濃度芝麻素處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后SOX9的免疫熒光表達(dá)Fig.2 A: ALP staining and expression in bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at various concentrations; B: Immunohistochemical expression of OSX in bone marrow mesenchymal stem cells treated with sesamin at different concentrations; C: Immunofluorescence expression of SOX9 after treatment in bone marrow mesenchymal stem cells.注：NC組：陰性對(duì)照，0.1%二甲亞砜處理；1組：1 μmol/L芝麻素處理；10組：10 μmol/L芝麻素處理；與NC組比較，*P<0.05；與NC組和1組比較，#P<0.05。

以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下，芝麻素激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

3 討論

本研究應(yīng)用不同濃度的芝麻素(1 μmol/L或10 μmol/L)干預(yù)由SD大鼠股骨分離而來(lái)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，共3 d。結(jié)果表明，芝麻素處理后細(xì)胞ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN的表達(dá)均顯著增強(qiáng)。此外，10 μmol/L的芝麻素對(duì)上述蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用高于1 μmol/L的芝麻素。通過(guò)Western blotting檢測(cè)Wnt/β-catenin通路表達(dá)，結(jié)果顯示芝麻素對(duì)β-catenin和LRP5水平的上調(diào)，但對(duì)GSK-3b水平的下調(diào)，呈濃度依賴性。為證實(shí)Wnt/β-catenin在芝麻素促進(jìn)BMSCs成骨分化中的關(guān)鍵作用，研究使用FH535(1 μmol/L)沉默Wnt/β-catenin，后測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示，沉默Wnt/β-catenin通路后芝麻素干預(yù)組與非沉默空白對(duì)照組相比，RUNX2和OCN的表達(dá)無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明芝麻素通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)BMSCs的成骨分化。

一些生物標(biāo)志物已被證實(shí)在骨質(zhì)疏松的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。ALP[19]、OSX[20]、SOX9[21]、RUNX2[22-23]和OCN[23]已被證實(shí)與骨質(zhì)疏松有關(guān)。與健康人相比，骨質(zhì)疏松患者的ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN通常較低。此外，RUNX2在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[24-25]。因此，ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN可作為骨質(zhì)疏松或成骨分化的生物標(biāo)志物。先前的研究已經(jīng)證明Wnt/β-catenin途徑在骨質(zhì)疏松的發(fā)病和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，也被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)[26-30]。本研究中，芝麻素處理提高了ALP、OSX、SOX9、RUNX2和OCN水平，并激活了BMSCs中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。以上結(jié)果表明芝麻素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力，并具有通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑對(duì)骨質(zhì)疏松具有治療和預(yù)防作用，故而芝麻素可能是治療骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)。

綜上，本研究初步證實(shí)芝麻素具有調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的潛能，顯示了其對(duì)骨質(zhì)疏松的潛在治療和預(yù)防作用。