葛根素對絕經后骨質疏松大鼠骨代謝、骨密度及骨生物力學的影響

岳海振 蔡軍 馬新強 王英

聊城市中醫醫院骨科，山東 聊城 252000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指絕經后婦女卵巢功能衰退，雌激素分泌下降，成骨細胞性骨形成減少，破骨細胞功能性骨吸收增強，骨吸收大于骨形成，出現以骨量減少、骨強度降低、骨顯微結構退變，骨脆性增加為特征的一種代謝性骨疾病[1]。PMOP又稱為Ⅰ型骨質疏松癥，雌激素缺乏是PMOP的主要原因[2]。雌激素替代療法(estrogen replacement therapy，ERT)已被廣泛證實能有效地預防PMOP，但長期應用ERT也引發了一些副作用，如陰道流血、靜脈血栓、乳腺癌和子宮內膜癌等腫瘤性疾病[3]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，具有雌激素樣活性，具有促進成骨細胞增殖、分化和礦化，抑制破骨細胞性骨吸收和分化，同時具有改善骨代謝，減少骨吸收，促進骨形成，增加骨密度作用[4]。本實驗觀察研究葛根素對絕經后骨質疏松大鼠骨密度、骨生物力學和骨代謝的影響，探索其潛在的作用機制，旨在為臨床運用葛根素防治PMOP提供新方法和新思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、試劑與材料

SPF級16周齡雌性SD大鼠55只，體重320～350 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(京)2019-0005。葛根素注射液(100 mg/支，陜西安康制藥廠)，骨化三醇軟膠囊(蓋三淳，0.25 μg×10 s，正大制藥青島有限公司)。核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)、I型原膠原分子N端前肽(PINP)、人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和骨鈣素(BGP)試劑盒均購于美國CUSABIO公司，雌激素受體(ER)多克隆抗體購于美國R & D公司，SP試劑盒購于武漢博士德公司。LunariDXA型雙能X射線骨密度檢測儀購于美國GE公司，MTS-858型骨生物力學實驗機購于美國MA公司。

1.2 方法

1.2.1絕經后骨質疏松大鼠動物模型：參考“雙側卵巢摘除手術方法”構造骨質疏松大鼠動物模型[5]。嚴格無菌操作于大鼠背部正中線做長約3 cm縱向切口，鈍性分離，逐層進入腹腔，找到雙側菜花狀卵巢，結扎切除，徹底止血后間斷縫合，術后青霉素5萬U/d預防感染，1周后拆線。

1.2.2分組及藥物處理：術后8周評估造模成功率，成功造模評價標準：骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標準差)。SD大鼠造模成功48只，造模成功率87%。按隨機數字表法分為正常組、去卵巢組、葛根素組、骨化三醇組。參考《藥理實驗方法學》(第4版)：人與動物體表面積等效劑量比值，換算成大鼠的給藥劑量給予不同藥物干預6周[6]。正常組和去卵巢組：5 mL/kg 0.9%Nacl，ih，qd；葛根素組：葛根素35 mg/kg，ih，qd；骨化三醇組：0.25 μg，po，qd，連續給藥6周。

1.2.3標本取材：藥物干預結束后，采用急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速離心，3 000 r/min×10 min，EP管收集血清1～2 mL，-20 ℃保存備用。逐層剝離L4腰椎和雙側股骨，無菌生理鹽水濕紗布包裹，20 ℃保存。另留取椎體10%甲醛溶液固定，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d，制備石蠟切片，保存備用。

1.2.4檢測各組血清骨代謝指標：取出上清液，所有操作嚴格參照試劑盒說明書進行操作，檢測各組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平。

1.2.5檢測各組骨組織骨密度(BMD)和礦物含量(BMC)：取出待測大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區，以2.0 mm×2.0 mm為中心區域，應用軟件分析計算BMD和BMC值。

1.2.6檢測各組骨生物力學指標：取出右側股骨，游標卡尺測量股骨長度，將置于電子萬能生物力學材料試驗機進行三點彎曲力學試驗，固定骨標本位置，保持標本上下面水平，支點跨距20 mm，最大量程1 000 N，加載速度1 mm/min，計算機記錄儀記錄載荷-變形曲線。

1.2.7免疫組織化學染色法(SP法)檢測各組骨組織ER表達：參照SP法進行操作，脫蠟水化，H2O2封閉內源性過氧化酶，高溫高壓修復抗原，血清封閉特異性蛋白，加ER抗體孵育50 μL(1∶200)，4 ℃冰箱過夜，添加二抗(IgG，1∶200)室溫下孵育，DAB顯色，復染脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，高倍鏡每個標本隨機選取10個視野，取其均值。

1.2.8HE染色觀察各組骨組織形態學變化：參照HE染色法操作步驟，二甲苯、無水乙醇脫蠟水化，蘇木精染/伊紅染色，梯度乙醇脫水，甲苯透明后封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠骨代謝相關生化指標

去卵巢組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平較正常組均顯著增高(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平較去卵巢組均顯著降低(P<0.05)，葛根素組血清水平較骨化三醇組均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標比較Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers between each group

2.2 各組大鼠骨組織BMD和BMC

去卵巢組腰椎和股骨BMD和BMC較正常組顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組BMD和BMC較去卵巢組均增高(P<0.05)，葛根素組BMD和BMC較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腰椎和股骨BMD和BMC比較Table 2 Comparison of BMD and BMC in the lumbar spine and femur between each group

2.3 各組大鼠骨生物力學指標

去卵巢組股骨最大載荷、最大應力、最大位移和剛度較正常組均顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組骨生物力學指標較去卵巢組均顯著增高(P<0.05)，葛根素組骨生物力學指標較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學指標比較Table 3 Comparison of biomechanical indexes of the femur between each group

2.4 各組大鼠骨組織ER表達

ER蛋白主要表達于成骨細胞和破骨細胞胞核，陽性反應呈棕黃色顆粒狀。正常組、去卵巢組、骨化三醇組、葛根素組分別為(ER陽性細胞數/個)：2.02±0.36、0.97±0.23、1.34±0.25、1.86±0.30。去卵巢組ER蛋白表達較正常組均顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組ER蛋白表達較去卵巢組均顯著增高(P<0.05)，葛根素組ER蛋白表達較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化檢測各組大鼠骨組織ER表達(10×40)A：正常組；B：去卵巢組；C：骨化三醇組；D：葛根素組Fig.1 Immunohistochemical detection to observe the ER expression in bone tissue of rats in each group (10×40)A: Normal group; B: Ovariectomized group; C: Calcitriol group; D: Puerarin group

2.5 各組大鼠腰椎骨形態學改變

正常組骨皮質結構致密完整，骨小梁飽滿粗大，排列密集有序，髓腔小。去卵巢組骨皮質明顯變薄，骨小梁稀疏纖細或斷裂，排列紊亂，髓腔明顯擴大，空泡樣脂肪細胞增多。骨化三醇組骨皮質變厚，骨小梁數量稍增多，排列尚規則，網狀結構略微修復，骨髓腔稍小，造血細胞數量稍多。葛根素組骨皮質結構較完整，小梁數目明顯增多，致密均勻粗壯，骨髓腔變小，造血細胞數量較多。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組腰椎骨組織形態學變化(10×40)A：正常組；B：去卵巢組；C：骨化三醇組；D：葛根素組Fig.2 HE staining to observe the morphological changes of the lumbar vertebrae in each group (10×40)A: Normal group; B: Ovariectomized group; C: Calcitriol group; D: Puerarin group

3 討論

PMOP已成為中老年婦女的常見病和多發病，列為“世紀慢性隱形疾病”，骨折是PMOP的常見并發癥，嚴重危害中老年人健康生活[7]。女性卵巢功能衰竭所致雌激素分泌下降是PMOP發病的主要原因[8]。雌激素通過與成骨細胞受體結合，直接促進成骨細胞的增殖、分化及其基質蛋白合成，通過與破骨細胞的受體結合，抑制破骨細胞的溶骨性骨吸收功能[9]。當雌激素水平下降，其對破骨細胞的抑制作用減弱，溶骨破骨功能增強，破骨與成骨明顯失衡，骨吸收大于骨形成，導致骨質逐漸丟失[10]。ERT可以減少或預防雌激素不足引起的骨量丟失，并能防治PMOP。ERT曾被認為是治療PMOP的首選方案，但其副作用、危險性突出，限制了其臨床上治療PMOP[11]。因此尋找探索更安全有效、副作用更少的藥物代替ERT是一項迫在眉睫的任務。研究表明植物雌激素可替代治療PMOP[12]。

Pue是從天然植物豆科植物野葛根中提取分離出的一種異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，與雌激素結構類似，藥理作用廣泛，具有多種藥理活性作用[13]。近年來，其在防治骨質疏松方面日益受到關注。研究發現Pue能與內源性雌激素受體結合，對骨產生雌激素樣作用，不僅能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，直接抑制破骨細胞性骨吸收和分化，改善骨代謝；而且還能增加骨礦密度和骨強度含量，改善骨生物力學，使其有抗骨吸收、促進骨形成的作用[14]。

本研究結果提示葛根素組大鼠血清骨代謝指標、腰椎和股骨BMD和BMC、股骨骨生物力學指標較去卵巢組顯著升高(P<0.05)，葛根素組骨組織ER陽性細胞數較去卵巢組顯著增加(P<0.05)。葛根素組骨皮質結構較完整，骨小梁數目增多，致密均勻粗壯，連接成網狀，髓腔變小，造血細胞數量較多。說明葛根素通過提高絕經后骨質疏松大鼠雌激素水平，調節維持骨代謝，增加骨密度和骨強度，提高骨生物力學性能，改善骨組織病態結構。所以作者推測葛根素預防PMOP的主要作用機制可能是通過作用于骨細胞雌激素受體，發揮雌激素樣生理效應，調節骨代謝，增加骨量骨強度，改善骨結構，起到抗骨質疏松作用。黃彤等[15]研究表明葛根素可增加去卵巢大鼠骨礦含量、骨密度和骨強度作用，改善骨質疏松的生物學效應。大量體外細胞學研究表明葛根素能夠促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，促進骨形成，并呈濃度依賴性[16-17]。臨床研究表明葛根能明顯改善絕經后女性骨質疏松患者骨密度、VAS、活動能力等方面的臨床癥狀，且安全性高[18-19]。

綜上所述，中醫藥在防治絕經后骨質疏松癥有著悠久的歷史，葛根素通過提高絕經后骨質疏松大鼠雌激素水平，調節骨代謝，增加骨密度和骨強度，改善骨生物力學性能和骨組織形態學結構，起到抗骨質疏松療效和骨保護作用。葛根素因其毒副作用小，安全有效，給絕經后婦女帶來了福音，但還需進一步做大量的基礎和臨床研究。中草藥是我國傳統醫學的巨大寶庫，期待進一步在分子水平上更深入的研究，提高其生物利用度及藥物的靶向作用，使其能充分發揮藥理活性，提高藥物的臨床療效。