大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌水平檢測及其臨床意義

李春鴻 林養 鄧麗花 梁汝忠

大腸癌是消化系統常見惡性腫瘤的一種，據報道全世界新診斷的大腸癌病例數接近每年100萬，已躍居消化系統惡性腫瘤的第3位，僅次于胃癌、食管癌[1]。大腸癌起病隱匿，早期多無癥狀，多數患者出現明顯癥狀就診時已屬中晚期，5年生存率約為12%[2]。早發現、早治療為改善大腸癌患者臨床預后的關鍵因素[3]。目前臨床采用的檢測技術如大便潛血試驗、氣鋇灌腸、電子結腸鏡等，但存在精確性低、費用高、侵襲性大等缺陷，甚至還可能引起如腸出血、穿孔等并發癥，極大降低了患者的依從性[4]。人體消化道定居著各種腸道菌群，其在物質代謝、營養合成、免疫功能等方面起著重要作用。腸道菌群也是引起消化系統炎癥的主要因素之一，腸道菌群的改變及其代謝產物對大腸癌的發生發展有一定影響[5-6]。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）測定大腸癌患者體內的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平，并分析大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌發生、發展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究篩選2018年12月-2019年12月本院就診的60例大腸癌患者作為大腸癌組，納入標準：（1）符合文獻[7]《現代腫瘤學》大腸癌診斷標準，且通過腸鏡和術后病理檢查確診；大腸癌的臨床分期、分化程度、淋巴浸潤符合文獻[8]2002年國際抗癌聯盟（UICC）標準；（2）年齡20～75歲的初診者；（3）生存期預期超過3個月；（4）無結直腸手術史；（5）入院前未經抗腫瘤相關治療；（6）無特殊飲食習慣及近2周內未曾服用影響腸道菌群藥物。排除標準：（1）存在其他原發性腫瘤；（2）糞便樣本污染；（3）合并心、肝、腎、血液系統等疾??；（4）伴潰瘍性結腸炎、腸系膜炎癥及克羅恩病等消化性疾病；（5）長期腹瀉。選取同期在本院體檢中心體檢且結果均為健康者50例作為對照組，納入標準：（1）年齡40～75歲；（2）無消化道疾病史。排除標準：（1）病歷資料不完整；（2）近2周內反復腹瀉。大腸癌組男37例，女23例；年齡40～71歲，平均（62.56±9.14）歲；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期16例，Ⅳ期6例；腫瘤位置：結腸31例，直腸29例；分化程度：高分化21例，中低分化39例。對照組男35例，女15例；年齡43～70歲，平均（61.98±9.93）歲。兩組性別、年齡方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 大腸埃希菌、雙歧桿菌的檢測

收集兩組病例的新鮮大便，以天平稱取中段大便，每份5 g，存放于無菌離心管中，置于-80 ℃冰備用。設計大腸埃希菌、雙歧桿菌的引物，并以局部序列比對基本檢索工具在線核實其特異性，在上海生工生物工程技術服務有限公司合成。取0.5 g糞便樣本加入緩沖液，充分混勻，置于離心管中，3 000 r/min離心5 min取上清液，收集沉淀，使用酚/氯仿抽提純化法提取DNA，以核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠行電泳，觀察DNA片段的大小和完整性。實時熒光定量PCR Master Mix（2×）10 μl，上游引物（10 μmol/L）1.0 μl，下游引物（10 μmol/L）1.0 μl，cDNA 模 板（300 ng/μl）2.0 μl， 加 焦碳酸二乙酯補足為20 μl。反應后糞便標本所含細菌拷貝數由PCR儀分析其循環閾值（Ct值），并與標準曲線比較，獲得樣本菌群定量結果。制作標準曲線。取PCR反應產物與溴酚藍混勻，上樣，行瓊脂糖凝膠電泳，攝像、純化，核酸蛋白檢測儀檢測目標基因濃度，計算基因拷貝數，并將其稀釋為（10～109）copies/ml，作為標準品；取純化產物20 μl及糞腸球菌上、下游引物進行測序，對純化產物行熒光定量PCR，根讀取熒光數據，由系統軟件自動分析Ct值。

1.3 統計學處理

本研究數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，直線相關用Pearson相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較

大腸癌組大腸埃希菌水平明顯高于對照組，雙歧桿菌明顯低于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較 [copies/g，（±s）]

表1 兩組大腸埃希菌、雙歧桿菌水平比較 [copies/g，（±s）]

組別 大腸埃希菌 雙歧桿菌對照組（n=5 0） 4.3 7±0.6 5 9.3 0±1.4 7大腸癌組（n=6 0） 6.6 8±0.9 3 4.4 7±0.6 2 t值 1 3.9 3 8 1 3.0 9 9 P值 0.0 0 0 0.0 0 1

2.2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關系

大腸癌患者年齡、性別、腫瘤位置因素的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平差異無統計學意義（P＞0.05），分化程度、TNM分期因素的大腸埃希菌、雙歧桿菌水平差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

2.3 大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與臨床病理特征的相關性

經Pearson相關性分析，大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與分化程度和TNM分期呈明顯相關（P＜0.01），但與年齡、性別、腫瘤位置無相關性（P＞0.05），見表3。

表2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關系 [copies/g，（±s）]

表2 大腸埃希菌、雙歧桿菌與大腸癌臨床病理特征的關系 [copies/g，（±s）]

水平 t值 P值 水平 t值 P值年齡 ＜60歲（n=38） 6.51±0.99 0.103 ＞0.05 4.33±0.81 0.931 ＞0.05≥60歲（n=22） 6.85±1.25 4.63±0.77性別 男（n=37） 6.55±1.11 0.081 ＞0.05 4.29±0.89 0.962 ＞0.05女（n=23） 6.81±1.37 4.67±0.93分化程度 高（n=21） 3.93±0.55 14.401 ＜0.01 5.61±0.73 9.005 ＜0.01中低（n=39） 9.43±1.47 3.33±0.51腫瘤位置 結腸（n=31） 6.90±1.28 0.049 ＞0.05 4.21±0.68 0.994 ＞0.05直腸（n=29） 6.46±1.21 4.75±0.80 TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期（n=38） 3.46±0.51 12.133 ＜0.01 5.77±0.81 9.215 ＜0.01Ⅲ、Ⅳ期（n=22） 9.19±1.78 3.15±0.53因素 大腸埃希菌 雙歧桿菌

表3 大腸癌患者大腸埃希菌、雙歧桿菌與臨床病理特征的相關性分析

3 討論

腸道菌群與大腸癌發生發展的相關性已獲得醫學界的共識。生理狀態下腸道菌群保持著一種動態平衡，有助于正常腸道屏障功能的維持，對病原體產生免疫反應[9]。腸道菌群的平衡一旦被打破，出現腸道菌群失調，與許多疾病如肥胖、炎癥性腸病及大腸癌等相關[10]。特殊的腸道菌群可產生引起大腸癌風險的毒素，其能夠激活炎癥信號通路，導致DNA損害，最終引起腫瘤發生，如腸道菌群通過其代謝產物次級膽汁酸，在大腸癌的發生中起到重要作用[11]。

大腸埃希氏菌又被稱為大腸桿菌，主要為條件致病菌，可誘導腸道慢性炎癥、內毒素產生，參與腫瘤的發生發展過程[12]。目前已知致病性大腸桿菌能合成毒素cyclomodulins、細胞毒性壞死因子、循環抑制因子及大腸桿菌毒素[13]。cyclomodulins具有遺傳毒性和調節細胞周期的作用，能夠調節細胞增殖、分化和、凋亡[13]。大腸桿菌毒素具有由大腸桿菌多聚乙酰合成酶島所編碼多聚乙酰合成酶，此酶通過誘導人DNA雙鏈斷裂及染色體不穩定，協同促進大腸癌發生[13]。研究也表明具有多聚乙酰合成酶島的大腸桿菌在大腸癌患者中更常見，支持了致病性大腸桿菌在大腸癌發生發展過程中的促進作用[14]。本研究結果顯示，大腸癌組大腸埃希菌水平明顯高于對照組；大腸埃希菌與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無關，而與分化程度、TNM分期有關；經Pearson相關性分析，大腸埃希菌與大腸癌分化程度和TNM分期呈正相關，但與年齡、性別、腫瘤位置無相關性。文獻[15]報道大腸癌組患者大腸桿菌水平均明顯高于健康人群，大腸桿菌與大腸癌的TNM分期呈顯著性正相關。說明大腸埃希菌狀況與大腸癌的發生發展存在一定的相關性。

雙歧桿菌為人體腸道的益生菌，可合成多種維生素，有助于腸道的蠕動，增強機體的免疫功能[16]。臨床治療研究顯示雙歧桿菌可緩解晚期大腸癌患者使用伊立替康化療所引起的腹瀉發生，改善患者生活質量[17]。本研究結果顯示，大腸癌組雙歧桿菌明顯低于對照組，雙歧桿菌與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無關，而與分化程度、TNM分期有關；經Pearson相關性分析，雙歧桿菌與大腸癌的分化程度和TNM分期呈正呈明顯相關，但與年齡、性別、腫瘤位置無相關性。大量研究均證實了大腸癌組患者大腸桿菌水平均明顯高于健康人群，大腸桿菌與大腸癌的TNM分期呈顯著性正相關[15，18]。表明雙歧桿菌狀況與大腸癌的發生、發展密切相關。

綜上所述，大腸癌患者體內的大腸埃希菌明顯升高及雙歧桿菌顯著降低，且與大腸癌分化程度和臨床分期呈明顯相關性。但本研究所納入的樣本量較小，且未對腸道菌群失調對大腸癌發生、發展的作用機制進行探討，值得進一步研究。