同型半胱氨酸對腎小管上皮細胞IRE1/caspase12/caspase3通路的影響

龍艷君 袁 靜 董 蓉

貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科 貴州 貴陽 550002

血清或血漿同型半胱氨酸(Hcy)濃度升高,稱為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[1]。一項基于60754例來自中國19個省市36個研究報道的薈萃分析結(jié)果報道我國HHcy整體患病率為27.5%,近年發(fā)病率呈增加趨勢[2]。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),HHcy可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑加重小鼠的急性腎損傷[1]。因此,本研究將在細胞水平上,探討Hcy對腎小管上皮細胞p-IRE1/caspase12/caspase3通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和分組 大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)隨機分為同型半胱氨酸組(Hcy組)和對照組(Con組),分別用含終濃度為1mmol/L和0mmol/L的Hcy細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,以Western blotting檢測p-IRE1、cleaved-caspase12、cleaved-caspase3的表達。

1.2 Western blotting檢 測 p-IRE1、cleaved-caspase12、cleavedcaspase3的表達 收集細胞,提取總蛋白,測定蛋白濃度。加入等體積上樣緩沖液,96℃以上金屬浴10min。每上樣孔加100ug總蛋白行SDS-PAGE。濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在5%BSA中,室溫封閉1小時。分別加入稀釋的待測一抗,4℃搖床過夜。而后加辣過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG室溫孵育1小時。最后,將膜置于發(fā)光液中2min,在暗室中曝光、顯影、定影、洗片,并對蛋白質(zhì)條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,用統(tǒng)計軟件SPSS25.0完成統(tǒng)計分析。兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨立樣本t檢驗。p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與對照組相比,NRK-52E細胞經(jīng)過Hcy處理后p-IRE1、cleavedcaspase12、cleaved-caspase3的表達明顯增加(p＜0.05)(見下圖)。

3 討論

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸代謝過程中產(chǎn)生的一種含硫氨基酸。Hcy穩(wěn)態(tài)在各種細胞代謝途徑中起重要作用,Hcy的異常升高可導(dǎo)致細胞死亡[3,4]。凋亡是細胞死亡的主要形式之一。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),同型半胱氨酸升高可促進腎小管上皮細胞的凋亡[1]。細胞凋亡可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的肌醇依賴酶(IRE1)與免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Bip)解離后可發(fā)生自身磷酸化而激活,磷酸化的肌醇依賴酶(p-IRE1)可通過激活caspase12引起caspase3的活化,從而導(dǎo)致細胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示,Hcy處理后的NRK-52E細胞p-IRE1、cleavedcaspase12和cleaved-caspase3的表達增加,提示Hcy引起了腎小管上皮細胞IRE1/caspase12/caspase3通路的活化,這可能是其促進腎小管上皮細胞凋亡的機制之一。

Hcy促進了 NRK-52E細胞p-IRE1、cleaved-caspase12、cleavedcaspase3的表達

注:*p＜0.05 vs對照組