油橄欖果渣中多酚提取及活性研究進展

王安華，龍國清，王東東，於洪建，賈景明*

（1.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧沈陽110016；2.天津益倍生物科技集團有限公司，天津300457）

油橄欖（Olea europaea L.）為木犀科木犀欖屬油料作物，是世界著名的亞熱帶果樹和重要經濟林木，其果含有豐富的優質油橄欖油，具有極高的食用和藥用價值[1]。全世界亞熱帶地區均有引種栽培，以希臘、意大利、西班牙、土耳其、敘利亞等地中海地區最為盛行[2]。早在9 世紀，我國就有少量油橄欖零星種植，當時稱之為“齊墩果”，后在20 世紀60 年代初期，我國甘肅、四川、廣東、云南等地逐漸開始引種，并將“齊墩果”改名“油橄欖”[3]。油橄欖的生長和掛果對于土壤酸堿性、光照和環境濕度等氣候條件要求很高，北緯33°緯度帶被譽為“油橄欖的黃金生長帶”。我國甘肅省隴南市白龍江流域恰好處于最適合種植油橄欖的區域，在當地具有我國最大的油橄欖種植基地，其油橄欖種植面積與橄欖油產量都居于全國首位[4-5]。油橄欖全身都是寶，油橄欖果、橄欖油和油橄欖葉都有著非常豐富的利用價值[6]，甚至在榨油產生的果渣以及廢水中也都含有豐富的多酚類成分，如橄欖苦苷、羥基酪醇及酪醇等[7-8]。現代藥理學研究發現，油橄欖多酚具有抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、抗菌[12]、抗病毒[13]、抗衰老[14]、抗高血壓[15]和降血糖[16]等多種藥理活性，可應用于藥品、化妝品、保健食品和功能性食品。目前，油橄欖果實在榨取橄欖之后，其榨油果渣大量堆積，一直沒有一條合適的途徑用于橄欖果渣的合理利用，造成嚴重的資源浪費和環境污染。因此，本文基于油橄欖多酚的重要價值，對油橄欖果渣中多酚的提取工藝及其生物活性展開綜述，旨在為油橄欖果渣廢棄物的回收利用及相關產品的開發提供理論基礎。

1 油橄欖果渣中多酚的提取

目前油橄欖果渣中多酚提取方法有加熱回流提取法、溶劑萃取法、多種輔助提取法、超臨界流體萃取法及聯合提取法等。

1.1 加熱回流提取法

加熱回流提取法是最常見的一種提取方法。該方法主要通過持續不斷地加熱，使細胞因吸溶劑膨脹破裂，從而使得多酚從細胞內擴散到細胞外再擴散到外部溶劑中。其優點是設備簡單、工藝操作簡單、成本低等，廣泛應用于工業化生產。但也存在提取時間長等缺點，還有待改善。

謝碧秀等[17]以丙酮為溶劑，采用加熱回流提取法提取油橄欖果渣，通過正交設計得到了最優提取工藝，即75%的丙酮，溫度為60 ℃，料液比為1 ∶13（g/mL），浸提時間為4h，優選工藝提取的多酚含量為0.2448%。IOANNIS 等[18]以無毒環保的甘油-水為提取溶劑，以2-羥丙基-β-環糊精作為增強劑（形成水溶性包合物提高橄欖多酚的可提取性），通過響應曲面法確定最優條件，即甘油濃度60%（質量體積比），環糊精濃度為7%（質量體積比），提取溫度為60 ℃，該工藝條件下所得多酚含量提取率為54.33 mg GAE/g dw（GAE 為沒食子酸當量；dw 表示油橄欖葉干重）。RIOS 等[19]將橄欖果渣先凍干，然后用乙醇-水低溫提取，最佳的乙醇和水的體積比為80 ∶20，最佳溫度為0 ℃～4 ℃。低溫大大減少了橄欖苦苷的水解，減少了30%的溶劑，縮短了33%的提取時間。

1.2 萃取法

萃取法操作簡單方便，多用于樣品的分離與提純，重現性也較高，但是該方法所需要的萃取溶劑較多且萃取時間一般較長。裴夢雪等[20]利用液液萃取法，以乙醇、甲醇、丙酮和水為萃取溶劑，研究了橄欖油中總多酚的提取工藝。最后研究發現，甲醇/水和丙酮/水的萃取效果最好，明顯優于乙醇/水，但考慮到丙酮易揮發且與橄欖油完全互溶，又有較大毒性的特點，最后選擇甲醇/水為主要萃取溶劑，得到了最佳的提取工藝：60%的甲醇為萃取溶劑，時間為60 min，提取3 次，料液比為1 ∶2（g/mL），在該條件下，所得油橄欖多酚提取率為11.16 mg/kg。

ROMERO 等[21]利用溶劑萃取法，以乙酸乙酯和正丁醇為萃取溶劑，對油橄欖果渣中橄欖苦苷、羥基酪醇和對羥基苯乙醇3 種多酚類化合物進行了研究。最終得到最佳萃取條件為乙酸乙酯∶正丁醇∶果渣廢液的體積比為1 ∶1 ∶1，此時得到羥基酪醇、對羥基苯乙醇和橄欖苦苷的提取率分別為92%、96%、83%。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取技術就是利用微波加熱的特性來對原材料中的有效成分進行選擇性提取的方法，通過調節微波加熱產生的振動作用，加速細胞內有效成分的釋放、擴散及快速溶解于提取溶劑，從而提高了有效成分的提取效率。該方法操作簡單、所需時間較短、且所需提取溶劑用量少，最近幾年在功能成分的提取方面運用較為廣泛。

舒適等[22]利用微波輔助技術，以乙醇為提取溶劑，對油橄欖果渣的多酚成分進行了提取，最后通過單因素和正交試驗，優化得到了油橄欖多酚最佳提取工藝：50%乙醇為提取溶劑、微波功率200 W、微波時間2 min、料液比為1 ∶20（g/mL）。在該提取條件下，油橄欖果渣中多酚的得率為0.97%。而孔維寶等[23]也采用乙醇為提取溶劑，運用微波輔助法提取了油橄欖果渣中的多酚類成分，得到的最佳提取條件與舒適等研究相似，且在該提取條件下，油橄欖果渣多酚含量可達1.02%，這樣的提取量比常規溶劑提取法提高了近40%。SELIN 等[24]利用微波輔助提取了橄欖果渣中總多酚和橄欖苦苷，通過響應曲面優化，得到的最佳工藝條件為微波功率250 W，提取時間2 min，在此工藝條件下總多酚的產率為2.48%，橄欖苦苷的產率為0.06%。

另外，JURMANOVIC 等[25]研究發現，將提取環境改為密閉容器系統中，以20%乙醇為萃取溶劑，微波施加700 W 的功率保持10 min，可得到羥基酪醇的收率為1.216 mg/500 g。王寒冬等[26]又將提取材料從果渣改為新鮮的油橄欖鮮果，得出了油橄欖多酚的最佳提取工藝條件為：微波功率490 W、微波時間48 s、料液比1 ∶23（g/mL），最終油橄欖多酚實際平均得率達到了6.965 9 mg/g。

1.4 超聲輔助提取

超聲輔助提取法是超聲技術在食品工業中的重要應用之一，即利用超聲波的特性，促使原材料組織、細胞破裂或變形，迫使有效成分溶出的一種提取方法。該方法提取效率較高，且由于不需要加熱，也適用于易揮發或易高溫降解的有效成分的提取。

宋照風等[27]以單因素試驗為基礎，進行二次正交旋轉試驗設計，優化得到了油橄欖多酚最佳提取條件，即提取溶劑為43%乙醇，超聲時間37 min、水浴溫度46 ℃、料液比為1 ∶32（g/mL），最終得到的油橄欖多酚提取率為14%。MOJERLOU 等[28]利用超聲輔助提取油橄欖多酚，通過響應面法優化得到最佳的提取條件為：超聲功率200 W，溫度56 ℃，超聲時間3 min，測定總酚類化合物含量為4.04 mg/g。

PETRA 等[29]建立了以60%乙醇為提取溶劑，超聲功率為400 W，溫度為70 ℃，超聲時間為120 min，同時加入環糊精作為提取增強劑，按1 ∶40（g/mL）料液比提取油橄欖果渣中多酚類成分，最終得到的提取物中橄欖苦苷、羥基酪醇和酪氨酸的含量分別為1 744、887、1 117 mg/kg。

1.5 酶解輔助提取法

目前酶解輔助提取法在酚類化合物的提取方面應用較少，有著極大的潛在開發價值。SOFIA 等[30]研究了酶解輔助法提取油橄欖多酚的工藝條件。以果膠酶和聚半乳糖醛酸酶聯合提取多酚的最佳工藝為：pH 值4.5，反應時間1 h，反應溫度40 ℃，料液比1 ∶12.5（g/mL），該方法最終得到總多酚的收率為8.42 mg/g。

1.6 其它提取方法

關于油橄欖多酚提取的研究，除上述方法以外，還有超臨界提取法，多項提取方式并用的聯合提取技術也用于油橄欖多酚的提取工藝研究。Ashley 等[31]采用超臨界流體萃取技術對油橄欖果渣進行了多酚提取研究，同時以DPPH 自由基清除能力為重要指標，確定了最佳提取條件，即60%乙醇為助溶劑，30 MPa 為的最佳壓力，溫度為50 ℃，時間為60 min。在該條件下，所得油橄欖多酚中羥基酪醇含量達到了1.25 mg/g，抗氧活性結果中EC50達到85.33 μg/mL，比常規的溶劑提取法所得多酚的抗氧化活性提高了23.33%。

項昭保等[32]采用超聲-微波協同提取的方法提取橄欖多酚。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化超聲-微波協同提取橄欖多酚的提取工藝。得到最佳提取工藝為：微波功率550 W，微波時間4.4 min，超聲功率330 W，乙醇濃度62%，得率為6.33%。

2 油橄欖果渣中多酚的生物活性

油橄欖果渣中富含橄欖苦苷、羥基酪醇、咖啡酸等多種酚類化合物，具有廣泛的藥理活性。現代藥理研究表明，油橄欖中的多酚類物質具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖及抗炎等生物活性。

2.1 抗氧化作用

油橄欖果渣中多酚對超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽等表現出良好的清除能力，間接反映了油橄欖多酚的體外抗氧化能力，當油橄欖果渣多酚提取物濃度為0.5 mg/mL 時，對亞硝酸鹽、超氧陰離子自由基的清除率分別達到52.27%、63.64%[17]。Masoud 等[33]還在體內水平探討了油橄欖多酚提取物作為天然抗氧化劑對無水乙醇誘導的腸黏膜損傷的抗氧化作用，結果顯示，油橄欖多酚治療組小鼠的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著升高；同時，相比于乙醇組對照組，多酚治療組小鼠的十二指腸絨毛受損明顯減輕或消失，黏膜層凝固性壞死減少，這都表明油橄欖多酚提取物具有顯著的抗氧化作用。此外，Alessandra 等[34]采用DPPH 法和ABTS 法測定油橄欖果渣提取物的總酚含量和抗氧化活性，試驗結果顯示，得出油橄欖80%乙醇提取物具有良好的抗氧化活性，抗氧化能力明顯優于純乙醇提取物，并提出該提取物可以作為食品工業中合成抗氧化劑的合適替代品，以提高食品質量。

而橄欖苦苷作為油橄欖多酚的特征性成分，多年來也受到諸多學者的關注。吲哚美辛是常見的甾體類抗炎藥，長期使用會導致胃潰瘍，因此Yavas 等[35]研究了以吲哚美辛誘導的大鼠產生胃潰瘍，然后灌胃給藥橄欖苦苷，考察橄欖苦苷對吲哚美辛誘導的大鼠胃潰瘍的抗氧化作用，結果顯示，當橄欖苦苷濃度達到18 mg/kg時，可見大鼠體內丙二醛和髓過氧化物酶的活性顯著降低，同時提高了大鼠組織中抗氧化酶的活性，這表明橄欖苦苷可能對吲哚美辛誘導的大鼠胃潰瘍和氧化應激有保護作用，表現出明顯的抗氧化特性。

2.2 抗腫瘤作用

關于油橄欖多酚類成分抗腫瘤活性的研究，主要集中在橄欖苦苷和羥基酪醇抑制多種腫瘤的生長、增殖、侵襲遷移、促進凋亡等方面。Yamada 等[36]用橄欖苦苷和羥基酪醇研究對人體肝癌細胞遷移的影響，研究結果表明，橄欖苦苷和羥基酪醇能夠明顯抑制TGF-α誘導的HuH7 細胞遷移，并呈現一定的劑量依賴性，同時機制研究顯示，它們能夠通過抑制肝癌細胞中p38 MAPK 和ρ 激酶途徑，達到抑制肝癌細胞遷移的作用。Mao 等[37]研究發現，橄欖苦苷可抑制人肺癌A549 細胞的增殖和遷移，并能誘導細胞內活性氧和甲烷二羧酸醛水平的濃度依賴性下降。Bhardwaj 等[38]使用雄激素依賴和雄激素不依賴（C4-2）的人類PCa 細胞系以及正常/良性（RWPE1 和RWPE2）前列腺上皮細胞系進行功能和生化檢測，以研究羥基酪醇對PCa 的生長抑制活性，結果觀察到羥基酪醇對這兩種前列腺癌細胞系均呈現劑量依賴性和時間依賴性抑制作用，而對正常人類前列腺上皮細胞無明顯作用；Annexin-V 染色，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]裂解等試驗也證明經羥基酪醇處理的LNCaP和C4-2 發生了明顯了細胞凋亡，同時，經羥基酪醇處理的PCa 細胞通過細胞外基質遷移和入侵的能力顯著下降；免疫印跡分析顯示，在羥基酪醇處理的PCa細胞中，Akt 和STAT3 的磷酸化水平降低，表明它們的活化程度降低。綜上，Bhardwaj 等提出，羥基酪醇可作為預防和治療前列腺癌的一種新的營養藥物。此外，Mansouri 等[39]還研究了橄欖苦苷針對乳腺癌中組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的表達影響，發現橄欖苦苷明顯降低MCF-7 細胞的侵襲和細胞活力，同時誘導MCF-7 細胞凋亡，并通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測發現，經橄欖苦苷作用后乳腺癌細胞中HDAC4 呈劑量依賴性降低，而HDAC1 的表達未見明顯變化，即橄欖苦苷可能通過調節MCF-7 細胞中重要的表觀遺傳因子HDAC4 誘導細胞凋亡，從而抑制細胞的增殖和侵襲，因此他們提出橄欖苦苷有可能成為預防和治療乳腺癌的新藥物。

2.3 抗炎作用

Chaoran 等[40]研究了油橄欖甲醇提取物（O.europaea L. methanol extract，OeME）和乙醇提取物（O. europaea L.ethanol extract，Ohee）對巨噬細胞RAW264.7 中炎癥介質NO 和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的產生、促炎基因表達水平和細胞內炎癥信號活性的影響，結果顯示，OeME 和Ohee 均能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Pam3CSK4 和poly （I：C）誘導的RAW264.7 細胞中NO 和PGE2 的產生，且二者均未表現出細胞毒性；OeME 和Ohee 還能夠下調環氧合酶-2 （COX-2）、iNOS、IL-6、IL-1、TNF-α 的mRNA表達水平，進而發揮抗炎作用。Park 等[41]研究了橄欖苦苷對LPS 誘導的BV-2 小膠質細胞的影響，研究發現，橄欖苦苷能夠抑制LPS 誘導的BV-2 細胞中促炎因子如NO 的產生，并抑制ERK/p38/NF-κB 激活和促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成；同時它還可以抑制LPS 誘導的BV-2 細胞線粒體過渡分裂，通過減少Drp1 去磷酸化來調節線粒體ROS 的生成和抑制小膠質細胞的促炎癥反應，這些研究表明，橄欖苦苷可能在小膠質細胞炎癥介導的神經退行性疾病中發揮重要作用。此外，對于橄欖苦苷的水解苷元，也有抗炎活性方面的相關報道，Daniela 等[42]通過脊髓損傷小鼠模型，考察了橄欖苦苷和其苷元的水解產物對脊髓損傷小鼠的抗炎作用，發現經過橄欖苦苷苷元處理的小鼠體內促炎細胞因子的產生明顯減少，如腫瘤壞死因子和一氧化氮合酶，推測橄欖苦苷苷元可能在各種炎癥疾病的治療中發揮作用。

2.4 抗菌作用

Ling 等[43]采用牛津杯碟擴散法研究了油橄欖果渣中14 種酚類化合物的對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑菌活性，包括橄欖苦苷、羥基酪醇、對羥基酪酚、丁香酚、咖啡酸和3，4-二羥基苯甲酸等，結果顯示，14 種酚類物質對兩種細菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直徑在10.2 cm～17.9 cm之間，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯優于大腸桿菌；從抑菌圈結果看，抑制效果最好的是羥基酪醇，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（24.8±0.1）mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為（17.9±0.2）mm，橄欖苦苷的作用次之，對兩種細菌的抑菌圈直徑分別為（20.4±0.1）mm和（14.6±0.1）mm。上述結果表明，羥基酪醇與橄欖苦苷都具有良好的抗菌活性。

此外，吳遵秋等[44]以濾紙片法考察橄欖苦苷對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，研究發現，橄欖苦苷可延緩這3 種細菌的對數生長期，當其濃度達到10 mg/mL 時，對大腸桿菌的抑制效果最為明顯，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.025 mg/mL，其次為金黃色葡萄球菌，MIC 為0.05 mg/mL，屬于高敏感狀態，對枯草芽孢桿菌的敏感程度相對較低，MIC 為0.4 mg/mL，表明橄欖苦苷對大腸桿菌等具有顯著抗菌作用。

2.5 抗病毒作用

在抗病毒方面，油橄欖也表現出一定的作用。病毒性出血敗血癥（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）的感染往往是致死性的，流行于歐洲大陸，Micol 等[45]研究發現，橄欖苦苷能抑制VHSV 的體外感染，將橄欖苦苷溶液加于感染該病毒36 h 后的細胞中，可劑量依賴型地大幅度降低病毒豐度和病毒蛋白的積累；同時，橄欖苦苷能夠抑制未感染細胞間與感染病毒細胞的膜融合，表明橄欖苦苷能夠干擾病毒的融合。Elisa 等[46]發現油橄欖中多酚類化合物羥基酪醇通過參與逆轉錄酶的合成來抑制HIV-1 病毒的復制，其可以作為一種潛在的消毒劑，用于預防HIV-1 的傳播或減少其在女性生殖道中的感染。

2.6 其它作用

Benlarbi 等[47]研究了橄欖苦苷對醛糖還原酶活性的抑制作用。研究結果表明橄欖苦苷對醛糖還原酶有明顯的體外抑制作用，在高血糖條件下，研究了橄欖苦苷對人視網膜視桿細胞和視錐細胞的體外保護作用，發現橄欖苦苷通過提高光感受器的生存能力來保護視網膜細胞免受葡萄糖的毒性作用。

Roberto 等[48]研究了特級初榨橄欖油的多酚成分橄欖苦苷對餐后血糖的作用及其機制，研究結果與對照組相比，服用橄欖苦苷的受試者血糖明顯降低，二肽基肽酶Ⅳ活性明顯降低，胰島素升高，其作用機制為橄欖苦苷通過阻礙NADPH 氧化酶2 衍生的氧化應激改善餐后血糖水平。

Pantano 等[49]在小鼠飲食中添加與橄欖油廠廢水中發現的同等劑量的多酚混合物，發現該多酚對小鼠認知功能具有顯著改善作用。Abe 等[50]研究橄欖油中的多酚橄欖苦苷對血管平滑肌細胞增殖的影響，在有橄欖苦苷存在的情況下，細胞增殖抑制率達到92%，機制研究表明，橄欖苦苷通過在G1 期和S 期之間的細胞周期阻滯來抑制平滑肌細胞的增殖，這可能是由于通過ERK1/2 調控的。

3 總結與展望

橄欖油由于具有豐富的營養價值和保健功能而受到人們的廣泛青睞，而在生產橄欖油的過程中會產生大量果渣廢棄物，其中殘留有大量的多酚類物質未被加工利用，這不僅造成資源的浪費，而且引起嚴重的環境污染。本文以油橄欖果渣為研究對象，綜述了幾種提取油橄欖多酚的現代工藝研究方法，并系統地總結油橄欖果渣中多酚類成分的現代藥理活性。這將對實現橄欖油加工廢棄物的綜合利用與其活性化合物的綜合開發利用提供重要的參考價值，以期為開發油橄欖果渣中多酚類物質相關的產品提供依據。