生態發酵技術原理與應用

杜如冰，任聰，吳群，徐巖*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院,釀造微生物學與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122)

傳統發酵食品營養豐富、風味獨特，分布在全球不同的國家和地區。據統計，全球發酵食品種類多達200余種，在人類飲食結構中扮演著重要角色。根據原料分類，可將發酵食品分為發酵酒精飲料、發酵豆制品、發酵奶制品、發酵面制品、發酵茶、發酵蔬菜和發酵肉制品(表1)。以高梁、大米、大豆、蔬菜等為原料的發酵食品多來源于以農業為主的東方國家，例如中國的白酒、黃酒和食醋，日本的清酒和納豆以及韓國的泡菜等；以動物乳、動物肉等為原料的發酵食品，如干酪、火腿等多來源于以畜牧業為主的西方國家[1]。

部分傳統發酵食品技藝已經傳承數千年，早期用于食品的長期保存，現多用于獨特風味食品的加工。雖然發酵食品類別多、分布廣，但發酵技藝存在著相似之處：通常將環境中或者原料自身攜帶的微生物作為發酵劑，在發酵過程中，微生物群落通過降解原料中的多糖、脂質和蛋白質等大分子物質產生葡萄糖、氨基酸等小分子進而代謝產生醛類、醛類、酸類、酯類等豐富的風味物質，賦予產品豐富的營養價值和獨特的感官特征。因此，釀造微生物(組)直接影響了發酵產品的品質和質量，但是自然接種的發酵技藝不利于食品生產的穩定、安全和控制[2]。近年來，微生物組學、風味化學、發酵工學等領域的研究讓人們對參與食品發酵的微生物組成、結構、功能以及菌群過程控制有了深入的認識，逐步解析了傳統發酵食品的釀造機理，為傳統食品發酵技術的升級革新提供了充足的理論基礎。在此基礎上，本綜述定義了一種新型的發酵技術——生態發酵技術，系統介紹了生態發酵技術的原理與應用，并闡述了提出該技術的必要性和可行性，期望推動生態技術在不同釀造系統中的應用，加快傳統發酵食品的產業轉型和升級。

1 傳統發酵食品的特征

1.1 傳統發酵食品技藝特征

以蒸餾酒(中國白酒和威士忌)為例(圖1)，中國白酒是典型的傳統發酵食品，在制作過程中將高粱等原料經蒸煮、糊化等工藝處理后，以固態形式置于窖池中進行密閉自然發酵[3]；威士忌是典型的現代發酵食品，在生產過程中將發芽、存放、糖化后的谷類或者麥類原料搗碎，制成麥芽汁，以液態形式置于發酵罐中進行密閉發酵[4]。傳統發酵食品工藝具有如下特征：

(1)傳統發酵多采用自然接種的發酵方式。如在白酒發酵過程中，發酵微生物主要來源于“曲”和環境。研究發現，參與發酵過程的63%～91%細菌和20%～39%真菌是由發酵環境中的地面和操作工具所提供[5]。而在威士忌發酵過程中則是以人工添加的純種酵母作為發酵劑，且對無菌環境要求較高。發酵過程中來源于環境的雜菌污染容易導致生產失敗[6]。

圖1 中國白酒發酵傳統工藝與威士忌發酵工藝的比較Fig.1 Comparison of Baijiu and Whisky fermentation technology

(2)傳統食品發酵屬于多菌種混合發酵體系(表1)。如在白酒發酵過程中，可以檢測到豐富的霉菌(Aspergillus、Mucor、Rhizopus和Rhizomucor等)、酵母菌(Saccharomyces、Candida、Issatchenkia、Pichia、Zygosomyces和Schizosaccharomyces等)和細菌(Lactobacillus、Pediococcus、Weissella以及Bacillus等)[7]，在上述多種微生物共同作用下完成邊糖化邊發酵的發酵過程。而威士忌則是在發酵前完成糖化，由單種或多種純種酵母菌完成。

(3)傳統發酵食品品質控制為終端控制，即僅能對最終的產品進行測評。如在白酒發酵過程中，原料入池后無法對發酵過程中的參數以及參與發酵的微生物進行實時調控，控制產品品質。

與現代發酵的威士忌相比，中國白酒由于復雜的發酵工藝和發酵菌群使產品呈現出更豐富的風味、更高的營養和更好的口感。同時，發酵系統與自然環境的長時間交互形成了獨特的發酵食品微生態，蘊含著基于釀造環境、生產原料與微生物之間相互作用的復雜釀造機制。

1.2 傳統發酵工藝亟需技術革新

目前，由于基于純種微生物的發酵過程對環境依賴性較小、生產周期較短、操作方式簡單，在工業生產上已實現機械化、自動化和智能化，大大提高了生產效率，例如威士忌。而基于自然接種的發酵過程周期長、微生物組成復雜、環境依賴性較強，阻礙了生產效率的提高。現在有些自然發酵食品已嘗試使用純種微生物接種方式取代自然接種，例如日本醬油，將傳統自然接種的制曲工藝改為人工接種，提高了生產的可控性。雖然我國發酵食品領域也對自然接種的發酵工藝進行革新例如麩曲白酒生產，但是由于不同發酵產品涉及不同的制作工藝和復雜的微生物群體，目前大多數傳統發酵食品產業依然沿襲粗放的傳統經驗式操作模式進行生產，使得傳統發酵食品行業的產品生產穩定性問題始終沒有很好地解決。

通過選育源于自然發酵劑的功能微生物，直接代替自然發酵劑并不能保證產品質量，同時需要考慮釀造環境微生物對發酵過程的影響。以中國白酒為例，目前通過擴大生產規模是提高生產效率的主要方式，但實踐證明在使用相同發酵劑的條件下，由于新老廠區環境微生物的不同，新廠區的出酒率以及產品品質明顯低于老產區[8]。因此，提高新產區產品優質率需要長時間馴化和篩選特定的環境微生物，例如源于地面、操作工具[5]或窖泥等環境的微生物。

由于開放式的操作工藝，產品存在潛在的食品安全隱患。如普洱茶發酵過程中，環境中某些真菌的富集可能造成真菌毒素的污染[9]；在白酒發酵過程中同樣存在真菌毒素的污染隱患，研究顯示大曲制作過程中自然接種上的青霉屬、曲霉屬等部分微生物存在真菌毒素代謝能力，可能會導致產品中真菌毒素的積累[10]。這些由微生物引起的安全隱患造成了生產過程控制成本增加。因此，以發酵微生物組為核心的發酵技術創新是未來傳統釀造食品產業升級的必然趨勢。

2 生態發酵技術

2.1 生態發酵技術的定義

基于自然接種的發酵過程一般難以人為控制接種微生物種類，近年來傳統發酵微生物生態學與微生物組學技術不斷發展，傳統發酵科學機理得以解析，更多的釀造功能微生物被分離培養，為克服自然接種的局限性，理性構建新一代多菌種發酵技術奠定了基礎。生態發酵技術指運用微生物生態學和微生物組學原理，通過優化發酵工藝，對以最優配比純種微生物復合菌劑接種并對發酵菌群進行演替定向控制的發酵過程控制技術，實現微生物群落各功能種群協同生長與代謝，以較高效率生產出優質發酵產品。上述定義為狹義的生態發酵技術，強調了復合菌劑在生產中的應用。生態發酵技術的外延還包括：①自然接種的傳統發酵體系釀造微生物群落的解構；②發酵微生物菌群的重構。因此，生態發酵技術體系包括了上游

的釀造微生物菌群解構技術、中游的核心釀造微生物菌群重組技術和下游的發酵過程控制技術。需要特別指出，生態發酵技術與以往研究中多菌種發酵技術的重要區別在于生態發酵技術強調了對傳統發酵體系機理的解析，以更為理性的方式重構復合多菌種菌劑，在發酵過程中進行發酵參數檢測和控制，所生產的發酵產品品質不低于傳統自然接種發酵產品的品質。

基于合成微生物組的生態發酵技術可在一定程度上減少對原始環境微生物富集過程的依賴性，生產過程穩定性較高；相對于開放式的傳統發酵技術，生態發酵技術中參與發酵過程的微生物均需要進行安全指標測試，保證產品安全。同時，高底物分解能力、高風味代謝能力菌株的組合可以提高發酵性能。因此，基于合成微生物組的生態發酵技術具有高穩定性、高安全性和高效率的特點。

2.2 生態發酵體系的核心技術體系

生態發酵技術體系包括了上游的釀造微生物群落解構技術、中游的核心功能微生物菌群重組技術和下游的發酵過程控制技術(圖2)。

圖2 生態發酵技術原理Fig.2 Principle of ecological fermentation technology

(1)上游技術

上游技術的主要目的在于傳統發酵體系中微生物菌群解構(組成、結構、功能)，菌種的安全、發酵性能的評價。同時分離獲取菌種，構建核心功能微生物菌種數據庫，為中游核心功能微生物菌群的重構提供組裝依據和菌種。

近年來，研究人員對食品發酵微生物菌群的組成及演替規律進行了大量研究。研究發現參與發酵過程的微生物組成較為復雜。如在清香型白酒發酵中，有722個細菌物種分類單元(operational taxonomic units，OTUs)和1 504個真菌OTUs參與發酵，通過物種信息注釋，他們屬于包括Lactobacillus、Weissella、Lactococcus屬在內的49個細菌屬和Saccharomyces、Candida、Schizosaccharomyces在內的34個真菌屬[26]；在蝦醬發酵中，研究人員發現有3 593個OTUs參與，平均每個樣本中能檢測到多達513個OTUs[27]。雖然參與發酵的微生物組成復雜，但在發酵過程中微生物菌群存在一定的演替規律，例如在清香型白酒發酵過程細菌屬中，發酵起始微生物是以Pseudomonas和Bacillus為主，隨著發酵時間的推移，Lactobacillus逐步演變為絕對優勢微生物(相對豐度>80%)；真菌屬中Pichia是整個發酵過程的優勢微生物(平均豐度>10%)，其次是Geotrichum、Saccharomyces等酵母[26]。相似的現象同樣也在其他香型白酒中發現，芝麻香型白酒發酵過程中發酵起始細菌屬以Bacillus、Staphylococcus等非乳桿菌屬為優勢微生物，隨著發酵的進行，Lactobacillus成為絕對優勢微生物(相對豐度>80%)；真菌屬Pichia、Saccharomyces是整個發酵過程中的優勢微生物[28]。在特定釀造環境下微生物菌群的演替規律穩定性是發酵產品品質穩定的保證，同時也表明存在潛在的功能微生物組成以及動力學演替規律，這種規律為使用合成微生物組代替自然菌群提供一種可能。

在菌種功能研究中，科研人員在不同的發酵系統中發現了大量的功能菌種或菌群并得到純培養物。在食醋發酵體系中，乙偶姻是食醋產品的重要風味成分，LU等人[29]發現,Acetobacterpasteurianus和4種Lactobacillus(L.buchneri，L.reuteri，L.fermentum和L.brevis)是乙偶姻合成的功能微生物群。在白酒釀造中，氨基甲酸乙酯是2A類致癌物，對人體存在潛在的致癌性和毒性，廣泛存在于酒、醋、醬油和干酪等發酵產品中。CUI等[30]在白酒發酵酒醅中篩選出具有氨基甲酸乙酯及其前體尿素降解能力的LysinibacillussphaericusMT33，該菌株可代謝產生940 U/L的氨基甲酸乙酯水解酶和1 580 U/L的脲酶。同時，相關工作人員在研究過程中積累了多種可代謝產生關鍵風味化合物的功能微生物菌種(菌群)，例如，萜烯類化合物產生菌(Saccharomycescerevisiae)、對甲酚產生菌群(Clostridiumbutyricum，Clostridiumtyrobutyricum，Clostridiumaminovalericum和Eubacteriumcontortum)、己酸產生菌(ClostridiumkluyveriN6)、地衣素產生菌(BacilluslicheniformisATCC 14580)、四甲基吡嗪產生菌(BacillussubtilisCCTCC M 208157)、蛋白酶產菌(AspergillushennebergiiHX08)、硫化物產生菌群(SaccharomycescerevisiaeJZ109，LactobacillusbuchneriJZ-JN-2017)、產醬香芽孢桿菌(BacilluslicheniformisMT6，BacilluslicheniformisMT15)、Surfactin產生菌(BacillusamyloliquefaciensMT45)、土味素控制菌群(Bacillussubtilis2-16，Bacillusamyloliquefaciens1-45)等。功能微生物的鑒定和挖掘為中游技術合成微生物組提供可選擇的菌種。風味化學研究中，不同特征的風味成分不斷被鑒定，近期研究發現醬香型白酒中的咸菜味香氣是由8種不同化合物形成[31]，然而各種物質的形成機制以及相對應的功能微生物尚不清晰。因此，需要進一步完善功能微生物的數據庫。

(2)中游技術

中游技術旨在基于功能微生物構建合成微生物菌群，篩選出最優配比的純種微生物復合菌劑，包括設計、組裝、優化和測試4個模塊。

目前，研究人員已在部分自然發酵食品體系嘗試利用合成微生物組代替自然發酵菌群，對促進傳統發酵生產流程的簡化，提高生產機械化程度具有積極的作用。中國白酒通常采用大曲、小曲或麩曲作為發酵劑，經過固態發酵、固態蒸餾、儲存勾兌而成。徐巖等[32]建立了以功能微生物Rhizopusoryzae，Saccharomycescerevisiae，Pichiaanomala和Issatchenkiaorientalis為基礎的最小功能微生物菌群作為發酵劑的小曲清香型生產技術，實現大規模的機械化改造，推動小曲清香型白酒的產業升級。另外，WANG等[26]選擇5種微生物作為初始發酵劑(Lactobacillusacetotolerans，Pichiakudriavzevii，Geotrichumcandidum，Candidavini和Saccharomycescerevisiae)，在不接觸環境的條件下實現了微生物演替規律和風味特征的重現，這項研究結果表明合成微生物菌群可以在一定程度上減小傳統食品發酵對釀造環境的依賴。該推測同樣在豆醬發酵體系得到驗證：近期，JIA等[33]選擇Aspergillusoryzae，Bacillussubtilis，Staphylococcusgallinarum，Weissellaconfusa，Zygosaccharomycesrouxii作為起始發酵劑，重現了原位釀造微生物菌群的功能。另外，針對西方食品發酵，研究人員也進行了使用合成微生物群落替代自然發酵菌群的嘗試，并取得較好的效果。在奶酪發酵中，選擇參與發酵的6種高豐度微生物(Staphylococcus、Brevibacterium、Brachybacterium、Candida、Penicillium和Scopulariopsis，在超過50%的樣本中平均豐度>1%)作為起始發酵劑，成功復制了原始發酵菌群的演替規律[19]。可可豆是全球重要的發酵食品之一，ANDREW等[34]以功能組裝為原則構建含有5種微生物的合成微生物組進行模擬發酵(Saccharomycescerevisiae、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusfermentum、Acetobacterpasteurianus和Acetobactertropicalis)，結果顯示該5種微生物能夠模擬可可豆原位發酵過程中微生物演替規律和化學變化[35]。以上研究表明了用合成微生物組替代自然菌群的可行性。

但是目前合成微生物組技術體系的構建依然處于起步階段。在實際應用階段需要考慮以下方面：目前多數發酵食品的質量評價體系是多基于風味特征、口感、色澤等非統一量化的參數為依據，而在設計合成微生物組時需要提出明確的、可量化的質量評價指標作為功能定義，以此為依據設計并評價合成微生物組。因此，需要推行食品領域質量評價指標的精準量化和標準化。雖然傳統發酵食品微生物組研究已取得較大的進展，不同發酵食品微生物演替規律被揭示，但是依然存在包括微生物間相互作用以及高階互作在內的關鍵風味形成機制的研究空白，這將給合成微生物組的設計帶來困難。合成微生物組的研究并不能一蹴而就的，不能期望所設計的合成微生物組一次性達到既定的工作目標。合成微生物組的最終應用需要經過設計、構建、優化、測試多個回合來獲取必要的釀造原理，不斷對合成微生物組進行改造和優化，最終形成適合應用的合成微生物組。

(3)下游技術

下游技術是以合成微生物組為發酵劑應用于實際生產，包括合成微生物組的放大培養以及發酵過程控制，是科研成果與實際生產結合的重要環節。

目前，在發酵食品生產過程中，存在各種形式的菌種放大和保存方式，例如純種大曲、菌粉/麩曲、菌液等。最為典型的是已實現工業化生產的酸奶發酵劑(一種商業菌粉)，極大地方便了酸奶的制作過程，例如在市場流行的安琪十二菌型酸奶發酵劑、川秀雙歧桿菌七菌型發酵劑以及五菌型發酵劑等。但需要注意的是，在應用過程中不同發酵食品應根據微生物的特性以及自身的釀造工藝采取不同的放大策略，同時要綜合考慮在放大和儲存中，微生物活性和功能的變化。但對于傳統發酵食品菌種的培養和放大工藝，目前尚缺少系統的研究，如在白酒釀造領域和黃酒釀造領域，直投式復合菌劑的技術仍然處于初步開發階段。

目前的研究表明，通過調整發酵參數可實現對產品質量的控制，包括原料和理化參數。食品風味一方面由微生物代謝產生，另一方面由原料直接帶入。原料質量的差異會直接影響最終產品的風味，因此生產中對嚴格把關原料質量是穩定產品品質的基本保證。發酵原料為發酵微生物菌群提供可利用的營養物質，不同特征的原料會影響發酵過程中微生物菌群的結構和功能[36]，最終影響產品的特征，例如原料中的還原糖組成[37]以及碳氮比例[38]等。理化參數在一定程度上驅動微生物群落組裝和功能演替。以溫度為例，在酸面團發酵時，控制發酵溫度在21 ℃可使得成熟的酸面團完全由乳酸菌組成，在其繁殖過程中能夠抑制其他菌群的生長[39]；在干酪發酵過程中，提高干酪成熟溫度可促進蛋白水解、脂解和氨基酸分解代謝相關基因的表達，提高干酪的成熟率[40]。除此之外，還包括發酵過程中的pH[41]、水分[19]、微生物代謝產物[42]、鹽度[33]等理化參數。因此，生產中原料的選擇以及工藝參數的控制，對維持發酵微生物群落功能的穩定性至關重要。

生產參數的檢測手段也正隨著科學技術的進步不斷被開發和優化，并應用于傳統發酵食品行業。例如應用無線溫度傳感器在線檢測白酒窖池發酵溫度變化、應用低場核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)在線檢測固態發酵體系中的水分含量[43]。同時生產參數的數據已用于構建數學模型，推動生產工藝的進一步優化。例如在白酒生產中，JIN等[44]基于生產參數構建了以Han-Levenspiel方程為基礎的數學模型，準確地預測淀粉、乳酸、乙醇的含量變化。另外，很多企業已引入智能化生產線，實現發酵食品智能化和數字化生產，提高發酵過程控制的時效性和有效性。例如，勁牌有限公司較早的進行機械化工藝改革，實現了管理信息化、過程數據化、操作自動化[45]。今世緣酒業采用自動化圓盤制曲系統、自動化生產線、智能裝甑、自動分流接酒等現代化生產工藝，實現了白酒的機械化和自動化生產[46]。山東景芝股份有限公司將數字化釀造工藝管理系統應用于濃香型白酒機械化、自動化和智能化釀造生產中，實現對各道工序關鍵工藝參數的數字化管控，確保了白酒釀造生產的定量化、精細化和標準化操作[47]。

2.3 生態發酵技術的研究方法學體系

(1)微生物組學技術

隨著高通量測序、分析、統計學的發展，形成了包括宏組學、分析化學、分子生物學以及統計學在內的微生物組學技術。傳統發酵食品領域涉及的微生物組學技術主要用于研究參與發酵過程微生物的組成、結構和功能，服務于生態發酵上游技術。應對復雜的發酵微生物菌群，擴增子測序技術是目前應用最為廣泛的微生物群落研究手段。該技術時對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序，分析序列中的變異，用于研究微生物菌群的組成和結構。例如通常選擇16S rRNA V4、V3-V4區通用引物研究細菌菌群組成，選擇ITS 1區、ITS 2的通用引物研究真菌組成。得益于高通量、低成本的優點，擴增子測序技術已逐步取代了基于細胞形態學的可培養方法以及基于分子生物學的DGGE等方法。宏基因組學、宏轉錄組學和宏蛋白組學主要用于在不同水平上研究微生物菌群功能分布。宏基因組(metagenome)被定義為區域內全部微生物遺傳物質的總和，既包括轉錄活性基因也包括非轉錄活性基因，屬于DNA水平。宏轉錄組(metatranscriptome)則是測定微生物群落宏基因組中在特定時刻下的具有轉錄活性基因的存在數量，屬于RNA水平。宏蛋白質組(metaproteome)是測定環境樣本中全部微生物蛋白質的總和，屬于蛋白質水平。在應用中，研究人員通過重構目標產物的合成或分解代謝網絡，基于測序結果中的物種以及功能注釋，判定相應途徑的功能微生物，可在分子水平解析釀造機制。同時，在構建新型化合物或未知代謝途徑化合物的代謝途徑時，同位素示蹤技術以及基因工程等均是可采用的技術手段。統計學分析同樣也應用于微生物功能的判定，例如應用較多的雙向正交偏最小二乘回歸模型(bidirectional orthogonal partial least squares regression，O2PLS)、偏最小二乘回歸模型(partial least-squares regression，PLS)、斯皮爾曼相關性等。微生物組學技術的發展為揭示釀造機制及挖掘功能微生物提供了強有力的支撐，允許研究人員針對不同科學需要、實際條件選擇可行的技術和分析方法。

(2)合成微生物組工程技術

合成微生物組工程技術包括了合成微生物組的設計、組裝、優化和測試。特別指出，合成微生物組工程技術需要對生產目標具有明確的功能定義，即設定可量化和測定的一個或多個參數，作為評價合成微生物組功能的依據。自上而下(top-down design)和自下而上(bottom-up design)是設計合成微生物組的常用原則。自上而下的設計原則是指通過調控環境變量，利用生態位的選擇改變現有微生物組組成和功能，達到設定目標，突出了環境選擇的重要性。自下而上則是要求以功能為導向構建代謝網絡，劃分功能模塊，并確定相應模塊的關鍵功能物種，從而實現微生物組的功能組合，突出理性設計的重要性。目前，自下而上的設計策略普遍被接受和應用。合成微生物組的組裝過程即根據設定的生產目標選擇相應的功能微生物，合成功能微生物菌群，并考慮菌群的功能魯棒性、結構穩定性等問題。合成微生物組的優化過程則是在小試或者中試規模優化微生物組合、接種量以及接種比例，基于正交試驗響應面分析、數學模型等統計工具預測最優組合。合成微生物組的測試過程則是對預測最優組合的合成微生物組進行功能測定，并與事先設定的功能定義比較。

(3)菌種放大和發酵過程控制技術

菌種的擴大培養是發酵生產的第一道工序(種子制備)。工業生產規模越大，單次發酵所需的種子就越多。因此，菌種擴大培養的目的就是要為每次發酵投料提供相當數量的代謝旺盛的種子。純種曲制作技術、麩曲制作技術、發酵菌粉制作技術等固態形式的菌種放大技術，菌株液態培養技術等液態形式的菌種放大技術均是應用于不同傳統發酵食品中的菌種擴大培養方法。其中細菌和酵母等既可以使用固態形式的菌種放大技術也可以使用液態形式的菌種放大技術。由于霉菌在液態基質培養條件下的產酶特征不同于固態基質，因此以產酶作為主要功能的霉菌需要選擇固態菌種放大技術。

發酵過程控制技術是穩定發酵過程的基本保證。發酵過程控制技術包括發酵參數檢測技術和發酵參數控制技術，是實現傳統發酵過程智能化、自動化、機械化的基礎。技術核心在于學習模型的構建(即解析發酵參數與發酵產品品質的對應關系)，通過調控發酵參數實時控制發酵過程，形成發酵參數收集、深度學習、發酵過程控制、發酵生產應用的良性循環。

3 展望：生態發酵技術未來研發方向

(1)生態發酵技術中菌種的選擇。確定功能菌種是實現合成微生物組發酵的關鍵因素。目前，食品發酵過程中微生物的組成研究主要依賴于擴增子測序技術。但是由于擴增長度的限制(<500 bp)，該方法較難實現種水平、株水平的微生物組成分析，僅能達到屬水平或者OTU水平，這使得無法準確確定功能微生物菌種信息[48]。另外，基于PCR的測序技術存在不可避免的引物偏好性、引物覆蓋度不全的問題,這將對解析微生物組成以及后續的分析帶來誤差。不依賴PCR的鳥槍測序(宏基因組測序)能夠有效地避免了PCR過程帶來的誤差；另外，可用的三代測序延長了測序的長度，提高了物種分辨能力，是未來釀造微生物組研究的發展方向。

(2)未培養微生物的可培養化是實現生態發酵技術應用的關鍵步驟。大部分自然界中的微生物(～99%)仍然難以培養，如中國白酒發酵系統的窖泥環境中存在大量未培養、功能未知的釀造功能微生物。目前，針對不可培養微生物對培養條件的嚴格依賴性，研究人員發明了5種可實現原位培養的技術：擴散室、分離芯片(iChip)、Trap技術、I-Tip技術以及膠囊包埋技術(GMDs)。2012年，GREUB 等[49]提出可培養組學的概念，實現微生物篩選條件的多樣化、鑒定過程的高通量，解決了微生物篩選鑒定的高成本和低通量的問題。目前，運用可培養組學技術已基本實現了腸道微生物的可培養化[50]。將原位培養技術以及可培養組學技術應用于傳統發酵食品領域，有利于完善釀造食品功能微生物數據庫。

(3)發酵過程自動化和智能化。首先，需要對發酵設備進行創新。目前，發酵過程中參數收集的困難阻礙了對發酵機制認識以及實驗中不同生產方案的應用反饋。例如在白酒發酵過程中，發酵容器為地下的密閉窖池，發酵過程中的理化參數收集需要以多次破壞的封閉體系為代價，多次的開窖取樣可能會對產品產生影響。使用具有發酵參數(含氧量、含水量、溫度、酸度等)采集和控制功能的集成發酵設備，可以在不破壞原有發酵狀態的前提下，快速、方便、密集地對發酵過程中各理化因子指標的變化進行在線跟蹤和調控，這將更有利于解析發酵機制，更有利于實時控制發酵過程，進而指導如何提高產品的優質率。其次，需要提高產品生產的靶向性和多樣性。生態發酵技術使得傳統發酵擺脫環境的限制，可以在實驗室規模優化發酵參數，如不同的合成微生物組組成、接種比例、不同的原料等。同時新型的發酵設備方便了發酵過程中參數的收集。因此，可通過整合不同方案中的發酵參數以及對應的產品特征，構建數學模型，編寫以發酵參數為輸入，產品特征為輸出的程序，并搭建用戶界面，構建產品靶向設計平臺。應用中以可檢測、可控制的參數為基礎，在線模擬生產過程和預測產品特征，一方面指導更合理地設計生產方案，提高生產效率；另一方面可用來設計更加多樣化的產品，以滿足消費者多元化的需求。