超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定陳年老茶中16種真菌毒素殘留

劉文靜，黃 彪，傅建煒*，韋 航，黃財標

（福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，福建省農產品質量安全重點實驗室，福建省茶葉質量檢測與技術推廣中心，福建 福州 350003）

中國是茶葉的生產、出口和消費大國，近年來關于茶葉尤其普洱茶、茯磚茶等發酵茶中真菌毒素污染已引起消費者的關注[1]。雖然茶葉加工過程干燥環節可能殺滅茶中的大多數微生物，但若包裝、貯藏不當，尤其茶葉吸濕受潮之后，仍可能受到真菌侵害并產生有毒的代謝產物[2]。陳年老茶亦稱年份茶，是指存儲一段時間后具有保健功能的茶葉，由于其需要存儲過程較長，存儲不當將有可能導致茶葉發霉變質，產生毒素。迄今發現超過400 種真菌毒素[3]，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等，這些毒素對人體具有致畸、致癌、致突變、中毒性腎損害、肝細胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等慢性毒性[4-6]。有研究表明茶葉中主要污染的真菌毒素為黃曲霉毒素[7]、赭曲霉毒素[8]、伏馬毒素[9]、玉米赤霉烯酮[10]、T-2毒素[11]等。

目前，茶葉中真菌毒素的檢測方法主要包括薄層色譜法[12-13]、酶聯免疫法[14-15]、液相色譜法[9,16]、液相色譜-串聯質譜法[17-18]等。其中液相色譜-串聯質譜聯用技術與其他方法相比，定量更加準確，選擇性和靈敏度也更高，已逐漸取代傳統的液相色譜方法應用于茶葉中真菌毒素的檢測。采用高效液相色譜-串聯質譜技術已建立了茶葉的赭曲霉毒素[18-19]、黃曲霉毒素[20-21]和玉米赤霉烯酮[22-23]的檢測方法。但上述檢測方法均針對單一毒素進行檢測，而同時檢測不同茶葉中多類、多組分真菌毒素低污染殘留的分析方法鮮見報道，一些真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[11,24]、玉米赤霉烯酮[25]仍然以酶聯免疫法進行檢測，由于茶葉中多酚類物質及其他次生代謝產物的干擾，酶聯免疫法存在假陽性結果，還需進行色譜確證[5]。QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged, and safe）技術是由化學家Lehotay和Anastassiadas于2003年提出[26]，目前，根據真菌毒素和樣品基質的理化特性，開發多真菌毒素的QuEChERS技術正逐漸成為真菌毒素研究領域的熱點[27]。本實驗針對茶葉中可能出現的16 種真菌毒素收集不同茶葉生產廠家的陳年老茶為研究對象，建立QuEChERS技術進行前處理，利用超高效液相色譜-串聯質譜同時測定陳年老茶中16 種真菌毒素的方法，以期為陳年老茶的安全衛生分析提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳年老茶購自福建省各茶葉店、茶廠。烏龍茶38 份：其中2005—2010年間存儲茶葉樣品16 份，2011—2015年間存儲的樣品17 份，2016—2018年間存儲的樣品5 份。白茶53 份：其中1993—2010年間存儲茶葉樣品16 份，2011—2015年間存儲的樣品18 份，2016—2018年間存儲的樣品19 份。紅茶30 份：2004—2010年間存儲茶葉樣品12 份，2011—2015年間存儲的樣品11 份，2016—2018年間存儲的樣品7 份。茶葉粉碎后貯藏于馬口鐵茶葉罐中。

16 種毒素標準品（純度＞98%）：伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、桔青毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素，上述16 種標準品均購自美國Romer公司。

QuEChERS提取鹽包（4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物）、dSPE凈化管（150 mg硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18、7 mg GCB）、Oasis PRIME HLB小柱（3 mL，150 mg）、Oasis HLB凈化柱（6 mL，150 mg）、甲酸（質譜純）美國Waters公司；PriboFast?Multi-Toxin IAC多毒素免疫親和柱 中國Pribolab公司；Mycosep 226柱（AflaZon+Multifunctional Coumns, 25 per pkg） 美國Romer Labs公司；GHP濾膜（0.2 μm） 美國頗爾公司。

甲醇、乙腈（均為質譜純） 德國Merck公司；超純水（實驗室一級水）由Millipore超純水機制備。

1.2 儀器與設備

UPLC H-Class超高效液相色譜-串聯質譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；TDL-5-A型低速大容量離心機 上海安亭科學儀器公司；Direct-Q?3UV型純水儀中國密理博有限公司 。

1.3 方法

1.3.1 茶葉樣品處理

茶葉樣品粉碎后過篩至粒度250 μm備用，每份樣品量需大于1 kg，稱取5 g茶葉樣品裝入50 mL離心管中，加入10 mL水和10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液置于自動振蕩器中振搖10 min。加入QuEChERS提取鹽包，振搖1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液進行待凈化。安裝Oasis PRIME HLB小柱，取約0.5 mL上清液通過Oasis PRIME HLB小柱，棄去濾液，然后再取1 mL上清液，再次通過小柱并收集濾液。將濾液移到含有混合吸附劑的dSPE凈化管中，10 000 r/min離心10 min，濾液過0.2 μm濾膜，待上機進樣。

1.3.2 標準溶液配制

標準儲備液配制：將16 種真菌毒素分別用甲醇稀釋至質量濃度為100 μg/mL標準儲備液，-20 ℃以下避光保存，根據后續實驗需要，各取不同體積毒素儲備液配制混合標準工作液置于10 mL棕色儲液瓶中，避光備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3C18柱，柱溫40 ℃；樣品溫度15 ℃，進樣體積2 μL，分析時間8 min；流速0.4 mL/min；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5 min，98% A，2% B；0.5～5.0 min，98%～5% A，2%～95% B；5～8 min，5%A，95% B；8.0～8.01 min，5%～98% A，95%～2% B；8.01～10 min，98% A，2% B。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；檢測方式：多反應離子監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細管電壓1.5 kV；錐孔氣流：氮氣，流速50 L/h；離子源溫度1 2 0 ℃；脫溶劑氣溫度5 0 0 ℃，流量1 000 L/h；碰撞氣：高純氬氣。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

根據16 種真菌毒素分子的化學電離性質，分別在電噴霧離子源正/負模式下采用全掃描模式方式選擇母離子、子離子掃描模式對子離子及碰撞能量、錐孔電壓等質譜參數進行優化，發現所有毒素在正離子模式下響應值均高于負離子模式，最終確定16 種真菌毒素的母離子、定性離子和定量離子參數，見表1。伏馬毒素B2與伏馬毒素B3，離子通道相接近，保留時間分別在5.22 min和3.03 min可以有效分離，其余化合物在各自的離子通道下不存在相互干擾，符合歐盟2002/657/EC號決議《質譜分析方法鑒定點數》中對待測物定性及定量的要求。

表1 不同真菌毒素檢測質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 mycotoxins

2.2 流動相的選擇

分別選擇甲醇-純水和乙腈-純水作為洗脫流動相，比較2 個流動相體系對分離效果的影響。實驗表明：以甲醇-純水為流動相時，黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1的響應值顯著降低；乙腈-純水為流動相時，伏馬毒素B2、伏馬毒素B3無法完全分離?？梢娨约兯鳛榱鲃酉鄷r，離子化效率較差，靈敏度低。為增強各組分物質離子化強度，本實驗在水溶液種添加甲酸（終體積分數分別為0.1%）。結果發現，加入0.1%甲酸溶液有利于抑制真菌毒素與色譜柱的靜電作用，避免拖尾現象，伏馬毒素峰形對稱性明顯得到改善；并可以增強黃曲霉毒素的響應值。因此本實驗最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相時，16 種毒素的色譜峰形和響應強度均理想，保留時間穩定，離子通道相接近的伏馬毒素B2與伏馬毒素B3可以充分分離。色譜條件優化后的真菌毒素總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 真菌毒素總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of mixture of 16 mycotoxins

2.3 提取條件優化

在實驗過程中，提取溶劑的選擇直接影響回收率的高低，為了獲得盡可能高的回收率，必須選擇提取效率高的溶劑。本實驗比較了乙腈、甲醇作為提取溶劑，實驗發現甲醇作為質子化溶劑相比乙腈具有更好的溶解性，但易將茶葉中的酸、醇、酚類物質提取出來而導致提取液中雜質較多；乙腈提取液相比甲醇提取液的脂肪和色素較少，有利于后續步驟的鹽析和凈化，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

部分毒素含羧基基團，對提取溶劑中酸度敏感，因此添加甲酸到提取溶劑中可以增強伏馬毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集團毒素的穩定性及回收率。從表2可知，提取溶劑中的甲酸含量對不同種類毒素回收率的影響不同，其中，4 種黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素和鐮刀菌烯醇受甲體積分數度變化的影響較??；其余10 種毒素均隨提取劑中甲酸濃度的增加而增加，但是當提取劑中甲酸體積分數達15%時，雪腐鐮刀菌烯醇、桔青毒素、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素的回收率下降，且與甲酸體積分數10%時相比達差異顯著水平（P＜0.05）。因此本實驗選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

表2 16 種真菌毒素在不同甲酸含量提取劑下的回收率Table 2 Recoveries of 16 mycotoxins extracted by acetonitrile with different formic acid concentrations

2.4 凈化柱選擇

采用Oasis PRIME HLB凈化柱第一步凈化，可以有效去除茶葉中大分子脂類雜質，再通過dSPE凈化管，凈化管含硫酸鎂成分可去除基質中水分，PSA去除茶葉基質中的糖類和酸性成分，C18主要吸收剩余殘留脂類成分，GCB主要去除茶葉中色素成分，應用上述凈化方法可以達到滿意回收率效果。本實驗以烏龍茶提取液配制基質標準溶液比較多毒素免疫親和柱[28]、Mycosep 226柱[29]、Oasis HLB凈化柱和Oasis PRIME HLB凈化柱，結果如表3所示，多毒素免疫親和柱可測的毒素種類不能覆蓋全部待測的16 種毒素，且前處理較為復雜，回收率低；Mycosep 226柱凈化對黃曲霉毒素G2和玉米赤霉烯酮回收率較低，去除色素效果也不理想；Oasis HLB小柱凈化效果不理想，并對毒素有吸附作用，導致回收率低，達不到實驗要求。因此本實驗采用Oasis PRIME HLB凈化柱結合dSPE凈化管方法可以降低茶葉復雜基質對毒素提取的干擾，達到凈化效果。

表3 4 種凈化柱對16 種真菌毒素回收率的影響Table 3 Effects of 4 purification columns on the recoveries of 16 mycotoxins

2.5 基質效應

圖2 16 種真菌毒素的基質效應Fig. 2 Matrix effects of 16 mycotoxins

以不含毒素的烏龍茶、紅茶、白茶作為基質空白，采用相同處理方法加入毒素混合標準溶液和流動相溶液，利用二者標準曲線斜率的比值評價不同茶葉基質對毒素的基質效應，比值一般在0.8～1.2定為基質效應不明顯，當比值大于1.2視為基質增強效應，比值小于0.8視為基質抑制效應[30]，測定結果如圖2所示，3 類茶葉中伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、HT-2毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇基質效應均大于1.2，增強效應的毒素種類約占31.3%，因此必須去除茶葉的基質干擾。本實驗采用基質匹配的標準溶液進行校準定量，根據成分補償基質效應，提高實驗回收率水平。

2.6 標準曲線、檢出限、定量限結果

依據樣品中16 種毒素基質效應強弱，配制不同濃度的混合標準溶液，以不同種茶葉空白基質提取液稀釋標準品母液，得到標準曲線工作液。按照1.3.3節條件進樣分析，以各組分的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪制出標準工作曲線。根據質譜MRM模式下響應不同，將配制好的最低濃度標準溶液添加到茶葉樣品進行處理進樣，根據真菌毒素在不同茶葉基質中最低添加濃度計算本方法的檢出限，根據茶葉基質標曲的最低點確定本方法的定量限。結果顯示，16 種真菌毒素的基質標準工作液在各自范圍內均呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999。由表4可知，方法檢出限在0.03～7.00 μg/kg之間，其中，黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的檢出限和定量限均低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量中的指標》[31]。

表4 真菌毒素的線性方程、檢出限和定量限（n=6）Table 4 Linear equations, LODs and LOQs of 16 mycotoxins in tea (n= 6)μg/kg

2.7 方法的加標回收率實驗

由于不同種類茶葉的基質效應具有一定的差別，因此茶葉中不同種類真菌毒素的定量限不同。本實驗根據真菌毒素在不同種類茶葉中定量限，設計低、中、高3 個水平進行加標回收率實驗，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。如表5所示，16 種真菌毒素的加標回收率為63.4%～109.7%，RSD為1.7%～11.3%，說明本實驗方法滿足實驗要求。

表5 不同種類茶葉的加標回收率及精密度（n=3）Table 5 Recoveries and precision of 16 mycotoxins spiked into different tea samples (n= 3)

續表5

2.8 茶葉實際樣品檢測結果

檢測福建省各地區共計121 份陳年老茶樣品（烏龍茶38 份、白茶53 份、紅茶30 份），其中1 份烏龍茶樣品檢出黃曲霉毒素B1，含量為34.0 μg/kg，參考GB 2761—2017的限量標準（5.0～20.0 μg/kg）超過限量值[31]，1 份紅茶樣品檢出赭曲霉毒素A，含量為1.6 μg/kg，參考GB 2761—2017的標準（5.0 μg/kg）未超限量值[31]。陳年老茶貯藏年份較長，放置環境發生變化或包裝損壞都可能導致茶葉受到真菌污染從而產生毒素危害人類健康。

3 結 論

本實驗建立一種超高效液相色譜-串聯質譜法測定不同種類陳年老茶中16 種真菌毒素的方法。樣品經甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液提取，加入QuEChERS鹽包振搖離心，提取液過OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管處理，以ACQUITY UPLC HSS T3C18色譜柱分離，采用電噴霧正離子模式掃描，MRM模式測定，茶葉基質匹配標準溶液，外標法定量。16 種真菌毒素在各自質量濃度范圍內呈良好線性關系。采用QuEChERS方法提取結合OASIS PRIME HLB小柱和dSPE凈化管雙重凈化的前處理方法，成本遠低于目前普遍采用的免疫親和柱，操作更簡單，無需活化和平衡步驟，可除去大部分基質干擾物，并且溶液流速更快，使得整個操作更順暢、更快速；采用高靈敏的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法同時測定16 種真菌毒素，提取時間短，20 min內即可完成，極大的提高測試的通量；經過優化后方法16 種真菌毒素的檢出限達到0.03～7.00 μg/kg，靈敏度較高，能滿足產品質量監督的要求。

QuEChERS是一種快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術[32]，分為提取、鹽析和凈化3 個步驟，提取是QuEChERS技術重要的組成部分，提取液的提取效率決定著最終分析結果的準確性。對于極性范圍敏感的目標樣品提取時，需在提取液中添加輔助試劑（乙酸、甲酸和甲醇等）以增強聯合提取的效果[33]。本實驗檢測發現，在甲酸添加量為1%～10%范圍內，16 種毒素回收率的平均值呈上升趨勢，超過10%略有下降，因此選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑，使16 種真菌毒素均有較高的回收率。

本實驗在陳年老茶中檢出真菌毒素，說明陳年老茶存在真菌毒素污染的安全隱患，目前針對茶葉中毒素的限值還沒有相關標準，因此極有必要建立茶葉中的真菌毒素限量標準及檢測標準。