基于突觸和突觸蛋白探討復方金思維對擬散發性阿爾茨海默病小鼠早期突觸傳遞和功能的影響

鞏卓彥 吳藝瓊 黃帥陽 劉珍洪 秦高鳳 王蓬文

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)起病隱匿并呈進行性發展趨勢，主要臨床表現為認知、生活及行為功能障礙，病變累及多個系統。突觸信號傳遞蛋白在神經信號的正常傳遞方面起到重要影響作用，其功能的缺失會進一步改變認知能力[1]。AD所發生的某些病理改變與谷氨酸受體缺陷有關[2]，其亞型代謝性谷氨酸受體5 (metabotropic glutamate receptors5, mGluR5)是突觸后膜介導Aβ寡聚體(A beta oligomers, Aβo )產生細胞毒性，破壞突觸正常傳遞功能并產生認知障礙的必要受體蛋白。研究膽堿能信號蛋白在突觸中的變化可以幫助進一步認識AD[3]。煙堿型乙酰膽堿受體家族中的α7尼古丁乙酰膽堿受體(α7-nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChRs)位于突觸前膜和后膜，前膜的α7-nAChRs調控釋放神經遞質，后膜的α7-nAChRs在包括主導學習記憶功能的海馬在內的多個腦區域調控突觸可塑性。突觸是AD病理變化出現的最早部位，在Aβ影響下其功能發生了改變，研究突觸的改變不僅能夠認識早期AD病理變化，而且可以幫助尋找治療AD的有效靶標。

中藥復方金思維是一種自草藥提取的混合物，由田金洲教授研究團隊在中國工程院院士王永炎教授指導下研制而成，其中包括由人參中的人參皂苷，來自菖蒲的細辛醇，遠志的細葉遠志皂苷，來自淫羊藿的黃酮苷，郁金中的姜黃素等八種有效成分[4-5]。輕度認知功能障礙是AD前認知功能的中間狀態，中藥復方金思維能夠顯著改善遺忘型輕度認知功能障礙患者的認知功能[6]；研究發現中藥復方金思維能通過抑制APPV717I小鼠腦內早老素1活性和促進胰島素降解酶和腦啡肽酶活性來降低Aβ水平[7]；有研究發現中藥復方金思維能通過增加AD模型大鼠海馬區GAP-43表達影響突觸可塑性[8]。然而，尚不清楚早期突觸傳遞和突觸功能障礙在中藥復方金思維改善早期認知損害中是否發揮重要作用，因此研究旨在通過觀察中藥復方金思維干預下擬散發性AD小鼠腦內突觸蛋白α7-nAChRs和mGluR5的表達變化，探討中藥復方金思維對AD病理變化中突觸傳遞和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備

復方金思維為專利制劑[9](專利號：2008100067330)(藥物組成：人參、肉蓯蓉、地黃、茯苓、石菖蒲、郁金、丹參和遠志)，由北京中醫藥大學東直門醫院藥房制備；鹽酸多奈哌齊購自衛材(中國)藥品有限公司，藥品批號：140625；羥甲基纖維素鈉由北京精求化工有限公司提供，批號：3405005；2.5%戊二醛和0.1MPB緩沖液購自北京陸軍總醫院；叔戊醇和多聚甲醛由北京化學試劑公司提供；一抗兔抗小鼠α7-AchR抗體(免疫組化抗體滴度1∶200)和mGluR5抗體 (免疫組化抗體滴度1∶500，Western blot抗體滴度1∶7500)由Abcam公司提供；Western-blot所用RIPA裂解液，批號：R0010；1M、1.5M Tris-HCL緩沖液，批號：A1010，T1020；SDS溶液，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，鏈脲佐菌素(Sigma)均由北京索萊寶科技有限公司提供；免疫組化所用檸檬酸鹽，貨號：ZLI：9064，RT；PBS緩沖液粉劑，貨號：9061；兔二步法試劑盒，貨號：PV-9001；小鼠二步法試劑盒，貨號：PV-9002，均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；Morris水迷宮測試及相關分析儀器購自上海移數信息科技有限公司；JEM-2100F型透射電鏡來自日本日立電子公司。

1.2 動物

實驗動物來自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號(京)：2012-0001]。雄性3月齡C57/BL6J小鼠，共計90只。由北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物室[實驗動物使用許可證號(京)：2015-0001]負責飼養，每日按時灌胃，小鼠自由飲水進食，定期更換墊料。本研究所用實驗動物經由北京中醫藥大學東直門醫院動物倫理委員會準許(倫理編號：16-13)。

1.3 動物分組及給藥

將90只C57/BL6J小鼠隨機分為6組(每組15只)：對照組、模型組、多奈哌齊組[0.92 mg/(kg·d)]及復方金思維大、中、小劑量組[20 mg/(kg·d)，10 mg/(kg·d)，5 mg/(kg·d)]。第1和第3天進行雙側側腦室造模：用叔戊醇對小鼠進行麻醉，剪掉頭頂上的毛發并用酒精消毒，沿中線剪開小鼠頭皮并暴露前囟，以前囟旁側1.0 mm和后側0.3 mm為坐標，向下進針2.5 mm，利用微量注射器注入3 μL液體。除對照組其余5組小鼠按照3 mg/kg濃度注射鏈脲佐菌素(Streptozocin, STZ)，對照組小鼠按照相同方法雙側側腦室注射等量生理鹽水[10-12]。造模1個月后給藥，每日定時灌胃，持續3個月。

1.4 Morris水迷宮測試

Morris水迷宮實驗中，第1天和第2天為訓練階段，第3天至第5天為測試階段，本次實驗旨在測試小鼠在訓練階段定位航行潛伏期的時間。

1.5 透視電鏡觀察

Morris水迷宮實驗結束，對小鼠(3只/組)進行灌注固定，斷頸，在冰上迅速剝離海馬，用2.5%戊二醛溶液進行固定，4℃靜置2小時，用PBS緩沖液沖洗3次。將海馬組織制成超薄切片，在×7000倍數視野下觀察小鼠海馬CA1區突觸超微結構，并對突觸的形態學變化進行分析。

1.6 Western blot檢測

Morris水迷宮實驗結束，對小鼠(6只/組)進行麻醉并進行斷頸處死，迅速取出海馬并置于EP管中并在液氮罐中保存。對組織進行蛋白提取并對其濃度進行測定；配膠并上樣；電泳跑濃縮膠時用60 V，使樣品壓成一條線，跑到分離膠以后用120 V跑，根據所要檢測的蛋白分子量大小來決定最終電泳停止的時間；轉膜后進行雜交，做雜交前應先進行膜封閉，然后進行抗體孵育；使用HRP-ECL發光法進行發光鑒定；用Hp Scanjet G4050儀器進行掃描并保存為TIF格式，并基于 Image J、Excel 軟件對其進行分析，得到相對百分數結果，基于 Prism 軟件制作柱狀圖進一步說明結果數據。

1.7 免疫組化檢測

Morris水迷宮實驗結束，對小鼠(6只/組)進行灌注固定，斷頸處死，迅速腦組織用多聚甲醛固定液進行固定，石蠟包埋后從冠狀面切成4m薄片，接著進行烤片、脫蠟、消除內源性過氧化物酶、抗原修復、抗體孵育、顯色、脫水、封片，最后每組選6張切片在×20倍顯微鏡視野下觀察海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞，并利用Image-pro Plus軟件進行分析。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 復方金思維對小鼠定位航行潛伏期的影響

實驗結果顯示，隨著訓練次數的增加每組小鼠定向航行潛伏期均縮短，具體表現如下：實驗期間，與對照組比較，模型組潛伏期明顯增加(P<0.01)；與模型組相比較，第四天，多奈哌齊組和復方金思維小劑量組潛伏期均縮短(P<0.01或P<0.05)；第五天，與模型組相比，多奈哌齊組和金思維各劑量組潛伏期均減短(P<0.01或P<0.05)。結果見表1。

表1 復方金思維對各組小鼠定位航行潛伏期的影響

2.2 復方金思維對小鼠突觸結構的影響

電鏡×7000倍視野下觀察小鼠突觸超微結構，結果顯示：對照組突觸結構正常且清晰，突觸前膜有大量球形突觸小泡，可見清晰的線粒體，突觸間隙寬度及形態正常，突觸后膜厚度正常且均勻(圖1A)；模型組突觸形態結構不完整，突觸內線粒體結構不清晰，突觸小泡分布零散且形態模糊(圖1B)；多奈哌齊組突觸結構清晰，前膜和后膜形態正常，可見較為清晰的線粒體結構，突觸間隙寬度正常(圖1C)；復方金思維各藥物組突觸形態及結構均基本正常，其中中劑量組可見結構完整且清晰的線粒體，小劑量組突觸前膜可見大量清晰的突觸小泡聚集，各組突觸間隙均寬度及形態正常(圖1D-F)。結果見圖1。

2.3 小鼠海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞數的變化

在×20倍顯微鏡視野下觀察海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞，實驗結果顯示：α7-nAChRs陽性細胞變化為：與對照組相比，模型組海馬CA1區陽性細胞數表達顯著減少(P<0.01)(圖2A、2B)；與模型組相比較，其他各藥物組海馬陽性細胞分布均較多(圖2C-F)，多奈哌齊組和復方金思維大劑量組表達均有所增加(P<0.05)。mGluR5陽性細胞變化為：與對照組相比，模型組陽性細胞數表達顯著增加(P<0.01)(圖3A、3B)；與模型組相比較，其他各藥物組海馬陽性細胞分布較少(圖3C-F)，多奈哌齊組，復方金思維大、中劑量組表達均有所減少(P<0.01或P<0.05)。綜合上述結果，多奈哌齊組和復方金思維大劑量組與模型組比較，海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5的陽性細胞數表達均有一定程度改善(P<0.05)。結果見圖2，圖3，表2。

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復方金思維大劑量組;E.復方金思維中劑量組;F.復方金思維小劑量組

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復方金思維大劑量組;E.復方金思維中劑量組;F.復方金思維小劑量組

注：A.對照組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.復方金思維大劑量組;E.復方金思維中劑量組;F.復方金思維小劑量組

表2 復方金思維對各組小鼠海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5陽性細胞數表達的影響

2.4 通過Western-blot實驗觀察小鼠海馬CA1區mGluR5的變化

實驗結果顯示，與對照組比較，模型組海馬CA1區該蛋白的表達有所增加(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組及復方金思維大、中劑量組小鼠海馬CA1區該蛋白的表達均有一定程度減少(P<0.01或P<0.05)。結果見表3，圖4。

表3 復方金思維對各組小鼠海馬CA1區mGluR5蛋白表達的影響

注：A.對照組；B.模型組；C.多奈哌齊組；D.復方金思維大劑量組；E.復方金思維中劑量組；F.復方金思維小劑量組

3 討論

突觸是神經元的特殊結構，神經遞質從突觸前軸突釋放到突觸間隙中，并激活突觸后樹突上的受體以傳遞信號[13]。隨著AD病情的發展，認知功能逐步惡化，突觸丟失尤為突出，特別是在海馬和皮層中。研究證明淀粉樣蛋白如Aβ和tau蛋白的沉積可能是導致AD早期發病階段出現突觸衰竭的發病機制[14]。除此之外，AD中突觸丟失的機制還可能涉及軸突運輸缺陷，氧化應激，線粒體損傷和神經炎癥等[15]。在神經傳遞過程中，信號分子如谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺等從突觸前神經元的活動區域釋放出來，與突觸后神經元的受體結合并激活受體。本實驗重點討論的突觸蛋白α7-nAChRs和mGluR5分別在神經信號傳遞中起重要作用[16]。尼古丁乙酰膽堿受體是調節學習和記憶功能的膽堿能信號重要介質[17]，尼古丁乙酰膽堿受體的激活會增加小膠質細胞對Aβ的吞噬作用，其亞型α7-nAChRs是調節興奮性神經遞質的重要蛋白，能夠提高學習記憶能力[18]。α7-nAChRs是一種配體門控離子通道受體，在細胞Ca2+信號傳導中起重要作用，通過G蛋白支架分子選擇性地作用于神經元。除此之外，Aβ能夠與α7-nAChRs高度結合并阻礙正常的α7-nAChRs通道進而影響其正常功能。研究表明α7-nAChRs受體激動劑激活可以觸發Ca2+通道信號[19]，促進突觸發育和可塑性，因此α7-nAChRs是治療AD等神經退行性疾病的關鍵藥物靶點。在AD病理變化中另一重要變化是Aβ對谷氨酸系統的影響[20]，谷氨酸作為哺乳動物中樞神經系統中一種主要的興奮性神經遞質，是影響突觸進行神經信號傳遞的重要物質，谷氨酸受體存在于神經元和神經膠質細胞中，不同于離子型谷氨酸受體，與膜內G蛋白偶聯的代謝性谷氨酸受體通過間接代謝過程激活進行興奮性傳遞，mGluR5受體主要在突觸后表達，激活該受體能夠促進Gαq/11蛋白活化，進而激活磷脂酶Cβ1，導致甘油二酯和三磷酸肌醇形成，促進Ca2+從細胞內釋放， Aβo 的慢性堆積可能會降低mGluR5對Ca2+的敏感性。在突觸后密集區(postsynaptic density, PSD)，細胞外Aβo與脂錨定蛋白細胞朊蛋白(cellular prion protein , PrPc)共同激活酪氨酸蛋白激酶Fyn從而干擾突觸信號傳遞，在所有的跨膜PSD蛋白中，只有mGluR5支持Aβo-PrPc與Fyn激活的偶聯。細胞內Ca2+和蛋白質的翻譯也通過mGluR5的介導與Aβo-PrPc過程產生關聯[21]。樹突棘喪失和轉基因記憶障礙需要mGluR5發揮輔助受體作用。總之，mGluR5激活是Aβo信號轉導的關鍵步驟，具有AD治療干預的潛力。

作為21世紀最嚴重的全球健康和社會危機之一的疾病，AD目前還沒有治療及治愈的方法，尋求有效治療方法和藥物，迫在眉睫。中醫藥治療AD獨具優勢。AD基本中醫病機為髓海虧虛，痰瘀阻滯，情志所傷以及瘀阻腦絡所致腦失所養，神明失用。髓海空虛和痰瘀阻絡是AD最典型的基本病機，在此基礎之上，中藥復方金思維針對腎虛和痰濁的病機，根據補腎助陽，化痰祛濁的治療原則組方用藥[22]，方中人參大補元氣，安神益智，肉蓯蓉補腎陽，益精血，地黃填精益髓，補腎滋陰，茯苓補腎益精，石菖蒲和遠志豁痰開竅，醒神益智，郁金和丹參活血化瘀，養血安神，諸藥共奏補腎助陽，化痰祛濁之效，針對其腎虛之本和痰濁之標進行治療。

本實驗通過Morris水迷宮測試小鼠學習記憶能力，結果顯示隨著訓練次數的增加每組小鼠定向航行潛伏期均縮短；超微電鏡觀察結果顯示與模型組相比，復方金思維藥物組小鼠海馬CA1區突觸結構有不同程度改善；通過免疫組化、Western-blot實驗觀察擬散發性AD小鼠海馬CA1區α7-nAChRs和mGluR5的表達和分布，免疫組化實驗結果顯示，與對照組相比，模型組海馬CA1區α7-nAChRs的陽性細胞數表達顯著減少，mGluR5的陽性細胞數表達顯著增加；與模型組相比較，多奈哌齊組和復方金思維大劑量組α7-nAChRs的陽性細胞數均有所增加，mGluR5有所減少，復方金思維中劑量組mGluR5的陽性細胞數也減少；Western-blot mGluR5實驗結果與免疫組化結果方向一致。這些結果說明中藥復方金思維能夠從一定程度上改善AD小鼠海馬區CA1區α7-nAChRs和mGluR5的分布和表達，推測可能是通過影響突觸結構和突觸傳遞信號中相關蛋白進一步影響突觸傳遞及功能，改變AD病理表現，改善AD認知能力。