干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

王譽(yù)穎，韓德平 , 閆 雪 , 劉雪連，吳 棟 , 王 佳 , 馬云飛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司 飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 海淀 100192)

雞白痢沙門菌是一種常見的腸道致病菌，在家禽之間廣泛傳播，嚴(yán)重影響家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對人類健康也造成一定的威脅。沙門菌感染腸上皮細(xì)胞后，促使上皮細(xì)胞及穿插的淋巴細(xì)胞分泌趨化因子，趨化因子吸引炎性細(xì)胞聚集到感染部位，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放，使炎癥進(jìn)一步加重[1]。益生菌對腸道黏膜具有保護(hù)作用，研究表明，益生菌能夠有效促進(jìn)消化道內(nèi)的菌群平衡，拮抗致病菌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高畜禽生產(chǎn)性能和飼料的利用率等[2-4]。本實驗室前期的研究表明[5]，飼喂干酪乳桿菌能維護(hù)斷奶仔豬腸黏膜結(jié)構(gòu)，減輕大腸桿菌的侵害。另有研究表明[6]，干酪乳桿菌能誘導(dǎo)腸道中T淋巴細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)腸道黏膜免疫。雛雞的盲腸具有腸絨毛，在組織結(jié)構(gòu)上不同于其他動物。同時盲腸是大腸的起始端，在雛雞腸道免疫中起重要的作用。腸絨毛的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量一定程度上反映腸道對抗外來刺激能力[7]。本研究采用組織學(xué)及免疫學(xué)的方法，探究經(jīng)口飼喂干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，旨為干酪乳桿菌作為一種預(yù)防雛雞雞白痢的新型飼料添加劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及樣品采集 干酪乳桿菌LactobacilluscaseiDBN023和雞白痢沙門菌SalmonellapullorumCMCC-533分別作為益生菌和致病菌模式菌株。干酪乳桿菌由大北農(nóng)飼用微生物國家重點實驗室提供，通過發(fā)酵凍干，制成菌粉添加到基礎(chǔ)日糧中，添加劑量為108CFU/g。雞白痢沙門菌CMCC-533由中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心提供，在第7日齡，需要攻毒的4個組口腔灌服半致死劑量雞白痢沙門菌，空白對照組和干酪乳桿菌組口服等量PBS 作為對照。選用450只1日齡SPF 健康雛雞，隨機(jī)分為6個處理組，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞，分組如下：(1)空白對照A組：飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，不進(jìn)行沙門菌感染；(2)沙 門菌攻毒B組：飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，進(jìn)行沙門菌感染；(3)干酪乳桿菌C組：飼喂添加干酪乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g， 不進(jìn)行沙門菌感染；(4)預(yù)防D組：前期飼喂添加植物乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g，進(jìn)行沙門菌感染后，飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧；(5)治療E組：前期飼喂無抗生素基礎(chǔ)日糧，進(jìn)行沙門菌感染后，飼喂添加干酪乳桿菌的基礎(chǔ)日糧，添加劑量為108CFU/g；(6)預(yù)防治療F組：全期飼喂添加干酪乳桿菌的無抗生素基礎(chǔ)日糧，添加劑量均為108CFU/g，并進(jìn)行沙門菌感染。在28日齡時，每組每個重復(fù)隨機(jī)選取1只雛雞，頸動脈放血致死，剖開腹腔，取2段盲腸中段2 cm 腸段，用PBS沖洗以除去腸內(nèi)容物。一段在4%多聚甲醛中固定48 h，期間換1次固定液，用于蘇木精和伊紅(H.E.)染色；另一段放入裝有RNA store[DP408，天根生化科技(北京)有限公司]液體的小管里，置于-80 ℃冰箱保存，用于進(jìn)一步分析細(xì)胞因子水平。

1.2 石蠟切片的制作及H.E.染色 將固定好的組織塊進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，準(zhǔn)備4 μm厚的連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染色15 min，1%鹽酸-酒精溶液分色后，自來水藍(lán)化15 min； 常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Nikon Ni-U顯微鏡觀察。

1.3 腸道細(xì)胞因子水平的測定 取出置于-80 ℃冰箱保存的盲腸腸段，根據(jù)制造商的協(xié)議使用雞ELISA測定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)測定盲腸中的細(xì)胞因子水平。腸道中的細(xì)胞因子分別使用雞白細(xì)胞介素-4(IL-4)ELISA檢測試劑盒、雞白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA檢測試劑盒、雞白細(xì)胞介素-17(IL-17)ELISA檢測試劑盒和雞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA測定試劑盒進(jìn)行測定。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 利用IPP 6.0軟件統(tǒng)計每100個柱狀上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞數(shù)量。采用SPSS 17.0 One-Way ANOVA模板進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理后雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的變化 空白對照組的絨毛結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛黏膜固有層無炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(見封二彩版圖1A)；沙門菌攻毒組絨毛黏膜固有層有炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(見封二彩版圖1B)；其他組與空白對照組相似，腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，無明顯病理變化(見封二彩版圖1C，1D，1E，1F)。表明干酪乳桿菌可以維持盲腸正常的黏膜組織形態(tài)，緩解沙門菌的損害作用。

圖1 干酪乳桿菌對雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的影響Fig. 1 Effect of Lactobacillus casei on the morphology of chickling caecum mucosaA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組； D：預(yù)防組； E：治療組； F：預(yù)防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group;D:Prevention group; E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

2.2 不同處理后雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著降低了30.31%(P=0.020)；與沙門菌攻毒組相比，預(yù)防治療組盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加了42.11%，差異顯著(P=0.027)。表明干酪乳桿菌可以增加盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)腸道免疫功能。見圖2。

圖2 干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響Fig. 2 Effects of Lactobacillus casei on the number of lymphocytes in the cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組；D：預(yù)防組； E：治療組； F：預(yù)防治療組注：柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05);下圖同A:Blank control group; B:Salmonella challenge group;C:Lactobacillus casei group; D:Prevention group;E:Treatment group; F:Preventive plus treatment groupNote: Different letters on the column indicate significant differences between groups (P<0.05).The same as below

2.3 不同處理后雛雞盲腸抗炎性因子表達(dá)量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組的表達(dá)量下降了42.39%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預(yù)防組、治療組、預(yù)防治療組IL-4的表達(dá)量分別增加了33.11%、57.23%、64.35%，差異極顯著(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。與空白對照組相比，沙門氏菌攻毒組IL-10的表達(dá)量下降了44.67%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預(yù)防組、治療組、預(yù)防治療組IL-10的表達(dá)量分別增加了49.09%、85.02%、102.7%，差異極顯著(P=0.001，P=0.000，P=0.000)。表明干酪乳桿菌促進(jìn)抗炎性因子的表達(dá)，增強(qiáng)腸道的抗炎能力。見圖3。

圖3 干酪乳桿菌對雛雞盲腸抗炎性因子表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of Lactobacillus casei on the expression of anti-inflammatory factors in the cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組； C：干酪乳桿菌組； D：預(yù)防組； E：治療組； F：預(yù)防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group;D:Prevention group; E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

2.4 不同處理后雛雞盲腸致炎性因子表達(dá)量的變化 與空白對照組相比，沙門菌攻毒組IL-17的表達(dá)量增加了53.47%，差異極顯著(P=0.000)；與沙門菌攻毒組相比，預(yù)防組、治療組、預(yù)防治療組IL-17的表達(dá)量分別下降了18.71%、25.21%、43.57%，差異極顯著(P=0.001，P=0.002，P=0.000)。與空白對照組相比，沙門菌攻毒組TNF-α的表達(dá)量分別增加了67.29%，差異極顯著(P=0.000);與沙門菌攻毒組相比，預(yù)防組、治療組、預(yù)防治療組TNF-α的表達(dá)量分別下降了23,34%、22.17%、40.29%，差異極顯著(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。表明干酪乳桿菌抑制致炎性因子的表達(dá)，避免過度的炎癥反應(yīng)。見圖4。

3 討論

3.1 干酪乳桿菌對雛雞盲腸黏膜組織形態(tài)的影響 腸黏膜屏障能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素的侵入，完整的腸黏膜上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，腸黏膜上皮細(xì)胞的受損可能導(dǎo)致腸道黏膜屏障的損害[8]。肉雞補(bǔ)充益生菌，其絨毛高度增加，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的更新[9]。本研究結(jié)果顯示，在沙門菌攻毒后腸上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落，而飼喂干酪乳桿菌進(jìn)行預(yù)防或治療的雛雞盲腸上皮細(xì)胞可以保持相對完整，說明干酪乳桿菌能有效抵御沙門菌對腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)的破壞，維護(hù)腸道黏膜屏障的完整性。

3.2 干酪乳桿菌對雛雞盲腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)是大量且多樣化的淋巴樣細(xì)胞群，其位于形成腸黏膜屏障的腸上皮細(xì)胞之間。IEL子集彼此之間以及與上皮外的免疫細(xì)胞相互通信，可促進(jìn)其屏障功能[10]。腸絨毛的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量在一定程度上反映腸道對抗外來刺激能力[7]。本研究結(jié)果中，沙門菌攻毒組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著下降，顯示腸道對抗外來刺激能力下降，免疫屏障受到破壞。有研究表明，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能增加腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，改善LPS誘導(dǎo)的大鼠損傷，維護(hù)腸道功能[11]。本研究結(jié)果顯示，飼喂干酪乳桿菌預(yù)防治療組IEL數(shù)量顯著高于沙門菌攻毒組。說明飼喂干酪乳桿菌能提高腸道的免疫功能，抵抗致病菌的入侵。

圖4 干酪乳桿菌對雛雞盲腸致炎性因子表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of Lactobacillus casei on the expression of inflammatory factors in cecum of chicksA：空白對照組； B：沙門菌攻毒組；C：干酪乳桿菌組； D：預(yù)防組； E：治療組；F：預(yù)防治療組A:Blank control group; B:Salmonella challenge group; C:Lactobacillus casei group; D:Prevention group;E:Treatment group; F:Preventive plus treatment group

3.3 干酪乳桿菌對雛雞盲腸細(xì)胞因子的影響 IEL在免疫監(jiān)視和細(xì)胞介導(dǎo)的黏膜免疫中具有重要的作用。病原菌侵入機(jī)體后，IEL可產(chǎn)生與多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的功能。根據(jù)細(xì)胞因子在炎性反應(yīng)中的作用不同分為2類：致炎細(xì)胞因子(IL-17、TNF-α等)和抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10等)。IL-4對巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-1、TNF和PGE2起負(fù)調(diào)節(jié)作用，提示它具有抗炎作用。IL-10是主要由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分泌的一種抑制免疫的細(xì)胞因子，它的主要作用是抑制炎癥反應(yīng)，防止炎癥擴(kuò)大化，在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)和抗感染中起關(guān)鍵作用[12-13]。IL-17由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，它可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的發(fā)育成熟，并且刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及纖維母細(xì)胞表面細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)。IL-17可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，IL-17在炎癥發(fā)生過程中起重要的調(diào)控作用[14]。TNF-α是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，它可使中性粒細(xì)胞在炎癥局部聚集并使其活化，能夠促進(jìn)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子，改變腸上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能，擴(kuò)大炎癥連鎖反應(yīng)，造成腸道組織的損害[15]。益生菌能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體腸道致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡，維持免疫穩(wěn)態(tài)，在提高機(jī)體免疫的同時，避免炎癥的發(fā)生[16]。有研究表明，干酪乳桿菌能夠誘導(dǎo)小鼠腸道中T淋巴細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)[6]。本研究表明，沙門菌攻毒后，致炎細(xì)胞因子IL-17、TNF-α的含量顯著增加，抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10的含量顯著降低，顯示動物機(jī)體誘發(fā)炎癥反應(yīng)。使用干酪乳桿菌預(yù)防或治療后抗炎因子IL-4、IL-10的含量顯著增加，致炎細(xì)胞因子IL-17、TNF-α含量顯著下降，說明干酪乳桿菌通過調(diào)節(jié)致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子含量的變化來減輕沙門菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，本研究結(jié)果顯示，干酪乳桿菌組致炎細(xì)胞因子IL-17、TNF-α的含量顯著高于空白對照組。根據(jù)已有研究結(jié)果IL-17A抑制或IL-17 RA型受體抑制可誘導(dǎo)或加重小鼠結(jié)腸炎模型[17]，以及乳桿菌誘導(dǎo)早期使細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)上調(diào)[18]，推測IL-17、TNF-α除對機(jī)體有促進(jìn)炎癥反應(yīng)外，可能存在其他影響，還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，飼喂干酪乳桿菌進(jìn)行預(yù)防治療能維護(hù)雛雞盲腸上皮細(xì)胞的完整性，保護(hù)腸道黏膜屏障，降低沙門菌的侵害。同時飼喂干酪乳桿菌能夠一定程度上提高雛雞腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡，增強(qiáng)腸道的免疫能力，緩解沙門菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究為干酪乳桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。