雞4種艾美耳球蟲單一蟲種與產氣莢膜梭菌共感染對雞生產性能的影響

龍航宇，呂夢娜，郭宸旭，尹樂子，林瑞慶

(1. 華南農業大學獸醫學院 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 廣東科貿職業學院，廣東 廣州 510430 ； 3. 廣州鐵路職業技術學院，廣東 廣州 510430)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種機會性致病的革蘭陽性人獸共患病病原菌，它在自然界中的分布范圍很廣，根據細菌所產生的4種毒素(α，β，ε和ι)可分為A、B、C、D和E五個型，引起雞壞死性腸炎(Necrotic enteritis，NE)主要為A型，近年的研究表明，該病也跟NetB毒素有關[1]。目前家禽NE的預防和治療仍以抗生素為主，但自歐盟等陸續立法在飼料中禁用抗生素添加劑以來，間接促進壞死性腸炎流行，雞壞死性腸炎的重要性逐漸提高[2-3]。對于NE病原學及防控相關研究需要有可靠且可重復的動物模型，本試驗以國內分離的堆型、巨型、柔嫩和毒害4種艾美耳球蟲分別與產氣莢膜梭菌廣東株共同感染嶺南黃雞，對雞只存活率、體重增長、料肉比、病變計分等數據進行比較分析，增進了解產氣莢膜梭菌與球蟲在腸炎發病上的協同關系，為建立可靠的產氣莢膜梭菌與艾美耳球蟲國內分離株共感染模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株及卵囊 A型產氣莢膜梭菌廣東分離株Cp2-4，為本實驗室分離、鑒定和保存。柔嫩、毒害、巨型、堆型艾美耳球蟲強毒株由本實驗室保存。

1.1.2 試驗動物 1日齡嶺南黃雞苗，購自廣東省農科院畜牧研究所，無球蟲環境下飼養至14日齡備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理及分組 試驗一：將60只14日齡供試雞隨機分成6組(A1～A6)，每組10只，感染情況如下:A1組：不感染；A2組：1×109CFU產氣莢膜梭菌/只；A3組：10 000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A4組：每1×109CFU產氣莢膜梭菌/只和10 000個 毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A5組：30 000個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；A6組：1× 109CFU產氣莢膜梭菌/只和30 000個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只。

試驗二：將60只14日齡供試雞隨機分成6組(B1～B6)，每組10只，感染情況如下：B1組：不感染；B2組：1×109CFU產氣莢膜梭菌/只；B3組：20 000個 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B4組：每1×109CFU產氣莢膜梭菌/只和20 000個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B5組：30 000個堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊/只；B6組：1×109CFU產氣莢膜梭菌/只和30 000個堆型美耳球蟲孢子化卵囊/只。

在17日齡時將飼料(含23%的蛋白質)替換成35%高蛋白飼料；18日齡時稱量所有組體重及飼料重，并按表1和表2分組感染1×109CFU/只的產氣莢膜梭菌Cp2-4。在20日齡時稱量體重及料重，每組剖殺5只雞，進行病變計分。

1.2.2 測定指標

存活率=(試驗結束時存活雞只數/試驗組雞只總數)×100%

平均增重=(最后存活的雞只總重/存活的雞只數)-(試驗開始雞只總重/開始時雞只數)

相對增重率=感染組的平均增重/不感染對照組的平均增重×100%

料肉比=消耗飼料總量(kg)/增重總量(kg)

小腸中段病變計分：0分，無肉眼可見變化；1分， 腸壁變薄或者小腸易碎；2分，局灶性壞死或潰瘍；3分，大塊壞死斑。

1.2.3 統計與分析 用GraphPad Prism 5軟件對試驗數據進行統計分析，利用單因素方差分析對兩組數據間進行差異分析，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 存活率 試驗一中單獨感染產氣莢膜梭菌組(A2)死亡1只雞，存活率為90%，其他各組存活率均為100%；試驗二中堆型+產氣莢膜梭菌組(B6)死亡1只雞，存活率為90%，其他各組存活率均為100%。試驗雞死亡發生在產氣莢膜梭菌人工感染之前，分析為非病原感染死亡，各組存活率無明顯差異。

2.2 相對增重率 感染產氣莢膜梭菌前，各組相對增重差異不明顯，感染產氣莢膜梭菌后，如表1所示，與陰性組(A1)相比，單獨感染產氣莢膜梭菌(A2)體重有下降，而毒害/巨型+產氣莢膜梭菌組(A4和A6)體重下降更明顯，共感染致病影響顯著；而表2中顯示，共感染柔嫩艾美耳球蟲與產氣莢膜梭菌(B4)其相對增重下降明顯，而共感染堆型艾美耳球蟲與梭菌(B6)其相對增重下降不明顯。

表1 試驗一相對增重影響比較Table 1 Comparison of relative weight gain of experiment 1

表2 試驗二相對增重比較Table 2 Comparison of relative weight gain of experiment 2

2.3 料肉比 相比對照組，各共感染組致病引起料肉比變化較大。在毒害/巨型+產氣莢膜梭菌試驗中，單獨感染梭菌組在感染梭菌后料肉比升高，毒害組、毒害+梭菌組及巨型+梭菌組料肉比由于試驗雞臨床癥狀較為嚴重，體重增長為負值，致料肉比也是負值；柔嫩/堆型+產氣莢膜梭菌試驗中，各感染組的料肉比都有升高，柔嫩組和柔嫩+梭菌組料肉比升高明顯。見表3。

表3 料肉比比較Table 3 Comparison analysis of feed meat ratio

2.4 病變計分 如圖1A所示，毒害+梭菌組與毒害組之間差異極顯著(P<0.001)，巨型+梭菌組與巨型組之間差異極顯著(P<0.001)；圖1B中柔嫩組與柔嫩+梭菌組以及堆型組與堆型+梭菌組之間差異不顯著。

圖1 腸道病變計分比較分析Fig. 1 Comparison analysis of gut lesion scoringA：毒害或巨型艾美耳球蟲與產氣莢膜梭菌共感染病變計分； B：柔嫩或堆型艾美耳球蟲與產氣莢膜梭菌共感染病變計分A:Gut lesion scoring of coinfections with E. necatrix(N) or E. maxima(M) and C.perfringens(Cp)； B:Gut lesion scoring of coinfections with E. tenella(T) or E. acervuline(A) and C.perfringens (Cp)**：P<0.01

3 討論

由于耐藥性問題以及飼料中抗生素的限制使用，雞壞死性腸炎發病率持續上升，尤其在養殖密度大和養殖條件差的環境下，發病越發嚴重，雞大量死亡及其生產性能下降，帶來巨大經濟損失。建立產氣莢膜梭菌發病模型，有利于尋找預防和治療該病的新方法。人工發病動物模型中，引起壞死性腸炎，需適當地添加輔助其發病的條件[4]。球蟲的感染導致腸內環境的改變被認為是觸發壞死性腸炎發生的一個主要因素；飼料的改變，尤其高蛋白飼料也是一個常見的誘發因素[5-6]。本次試驗使用4種雞艾美耳球蟲，配合飼料的改變，與產氣莢膜梭菌共感染試驗雞，模擬壞死性腸炎發病，以探究其對生產性能的影響。

本試驗結果發現，所用A型產氣莢膜梭菌有一定的毒力，單獨感染能引起雞的相對增重下降，除堆型艾美耳球蟲和產氣莢膜梭菌的共感染組合外，其他3種共感染組均促進壞死性腸炎病變的發生，相對增重比單獨感染產氣莢膜梭菌顯著下降。毒害或巨型艾美耳球蟲的共感染致病作用更加明顯，由于體重下降多導致增重量為負值，病變計分與單獨感染產氣莢膜梭菌組相比差異顯著。綜合相對增重、料肉比及病變計分等指標，在飼料轉為高蛋白情況下，毒害艾美耳球蟲/巨型艾美耳球蟲+產氣莢膜梭菌均能有效地引發試驗雞壞死性腸炎，對生產性能影響較嚴重。

NE動物模型是研究和防控該病的有利工具，但就目前國外已進行的一些研究，因為影響因素眾多，很難判定哪種動物模型更理想，本試驗參考國外的一些研究資料，對國內不同種球蟲分離株及產氣莢膜梭菌分離株共感染引致的試驗性NE進行比較分析，驗證其對試驗雞生產性能的影響，為進一步建立穩定的共感染NE動物模型提供科學依據，有助于研究NE的發病機理、病原與宿主的相互作用以及疾病預防和控制措施。