石墨烯對生殖毒性的研究進展

張靜，高玉，楊永秀，關徳鳳

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000；2.濟寧醫學院第二臨床醫學院，濟寧 272113；3.蘭州大學第一醫院生殖醫學中心，蘭州 730000)

石墨烯以氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)、石墨烯量子點(Graphene quantum dots，GQDs)、單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotube，SWCNT)等多種結構形式存在。2004年，Konstantin等首次從石墨中分離出石墨烯，之后學者們圍繞石墨烯在生物醫學中的應用展開了大量研究，包括藥物/基因傳遞、生物傳感和成像、抗菌材料、細胞培養的生物相容性支架等。此外石墨烯氧化物結合808 nm近紅外激光照射在癌癥化學光熱治療中具有巨大的潛力，已經成為癌癥治療的新材料[1-2]。石墨烯尤其是GO對于各種生物體會有毒性作用。體內研究發現，石墨烯會在不同的組織和器官蓄積，并對血液循環系統、呼吸系統、免疫系統、神經系統和肝腎功能造成不同程度的危害[3]。原始和功能化的石墨烯納米材料(Graphene nanomaterials，GNMs)在實驗室哺乳動物中表現出潛在的肺毒性、系統性毒性、行為毒性、生殖毒性和發育毒性以及基因毒性[4]。體外實驗表明，細胞或組織暴露于過量的GNMs會激活過量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，從而影響細胞的代謝和呼吸，同時會有炎癥反應的發生[3]，這可能是石墨烯的主要毒性機制。

一、石墨烯在生物器官中的蓄積

石墨烯顆粒可以有很多進入人體的途徑，如皮膚接觸、呼吸吸入、口腔黏膜以及眼結膜接觸等。Liang等[5]的研究表明，分別通過尾靜脈和腹部注射125I標記的GO 到雄性小鼠體內，從放射性水平來看，GO納米片主要分布在四個器官：肝臟、脾臟、肺和腎；小鼠尾靜脈注射后四個器官的GO濃度均顯著高于腹部注射后四個器官的GO濃度。此外，GNMs會在生殖器官中蓄積，研究者在雄性小鼠體內注射5 mg/kg的功能化石墨烯后，雖然小鼠在體重、睪丸以及附睪的重量上均未發生明顯變化，但是他們發現在處理10 min、60 min和24 h時睪丸中分別積累了41、61和151 ng的GNMs[6]。

目前對于石墨烯材料在生物器官的蓄積情況，實驗者只發現該材料存在于肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中，還需要更多的實驗來探索石墨烯在其他生物器官的蓄積情況。

二、石墨烯的生殖毒性

1.體外實驗：體外實驗研究發現，石墨烯對于生殖細胞有一定的毒性，并且它的毒性作用存在一定的劑量依賴性，這與石墨烯的理化特性密切相關。GQDs的暴露使得昆明小鼠卵母細胞在體外成熟過程中未能排出第一個極體，導致第一次極體排出失敗[7]。眾所周知，卵母細胞的減數分裂主要依賴于卵母細胞骨架組織肌動蛋白帽的動態變化，這一變化在時間和空間上受到高度調控，同時在卵母細胞成熟過程中，紡錘體處于不對稱位置是極體排出成功的關鍵[8-11]。研究者發現，GQDs暴露的小鼠卵母細胞成熟過程中紡錘體遷移和肌動蛋白帽形成失敗，可能導致第一次極體排出失敗[12]，從而影響卵母細胞的體外成熟；此外另有研究者發現，GQDs會阻斷小鼠精母細胞系(GC-2)和正常小鼠睪丸Sertoli細胞(TM4)自噬通量[13]，促進細胞的凋亡[12]，可能對男性生殖有潛在的危害。GNMs的毒性取決于劑量、暴露時間、細胞類型和聚集程度等多種因素[14]。有文獻報道，反復接觸GNMs對于小鼠的睪丸會產生可逆性的損傷，但是對精子體外活力并沒有很大的影響，并不影響生育能力[6]。但是也有研究發現，高劑量的GO可導致睪丸組織的損傷，包括生精小管萎縮、生發上皮細胞減少、生殖細胞丟失和空泡化[14]，由此影響精子活性。

Asghar等[15]的研究首次就還原GO對人類精子的毒性進行了初步評估，精子暴露于GO可能導致精子活力發生變化，但是根據世界衛生組織對精子運動性的評估標準，這種影響不會對人精子造成明顯的傷害，然而孵育于還原性GO的精子會產生ROS，由于ROS的存在，精子的運動速度和氧化應激發生了明顯的變化。氧化應激物質在濃度較高的情況下可能對男性生育能力產生不利影響。

上述結果表明，GNMs的暴露會導致哺乳動物生殖細胞的體外發育出現明顯異常，極有可能影響生育功能。

2.體內實驗：體內實驗研究表明，石墨烯對于生殖功能有一定的影響，具體作用不盡相同。在交配前或妊娠早期給雌性小鼠注射GO，未見明顯的生殖毒性，但是在臨產期前注射高劑量的GO會出現死產和流產現象[16]；在哺乳期間，母體含GO，水的攝入量減少，可能會減少乳汁的分泌，從而影響后代的生長發育[17]。

Wistar大鼠腹腔暴露于3種劑量GO，即低劑量(0.4 mg/kg)、中劑量(2.0 mg/kg)和高劑量(10.0 mg/kg)，重復暴露15 d和30 d的大鼠附睪精子計數下降和異常精子增多，活動精子的百分比也因暴露而顯著降低[14]。向性成熟雄性小鼠氣管內灌注四種分散在納米水中的GNMs，研究GNMs對肺炎后精子質量的影響，最后一次灌注后一周，暴露于納米顆粒組的小鼠支氣管肺泡液中性粒細胞顯示持續的炎癥反應，但是附睪精子參數、日精子產量和血漿睪酮水平均無顯著變化[18]。通過灌胃或靜脈注射，研究發現GQDs對雄性小鼠的性行為頻率和時間沒有影響，GQDs暴露的雄性小鼠睪丸和附睪的結構和功能、生殖生理(如健康精子的產生和儲存、睪丸中正常的總蛋白和關鍵酶濃度的維持)也無明顯影響，睪酮水平也保持正常，暴露于GQDs的雄鼠與雌鼠交配后第一、第二和隨后一窩的幼鼠都健康[19]。總之，只有有限的資料表明，靜脈注射還原GO和口服GO可能引起在體生殖毒性，但是在實際環境中，吸入石墨烯顆粒為石墨烯進入人體的主要方式，并且體外實驗表明石墨烯對生殖細胞有一定的毒性，所以需要更多入體途徑的研究來了解石墨烯的生殖毒性。

對其他模式生物的研究發現，除了哺乳動物，石墨烯對包括魚類、線蟲、水蚤和蟋蟀在內的多種生物的繁殖均有影響，并且對后代產生影響。兩代蟋蟀長期暴露于食物中的GO，接受GO處理的兩組蟋蟀的生殖能力都明顯低于對照組[20]；GO可在斑馬魚幼蟲的眼睛、心臟、卵黃囊和血管中積累累積[21]；Manjunatha等首次闡明了不同濃度原始石墨烯可導致斑馬魚胚胎心臟發育不全及其特定的心血管缺陷[22]，高濃度的GO(0.41 mg/ml)會導致顯著的胚胎死亡率升高[23]；Kim等[24]研究發現GO會在秀麗隱桿線蟲生殖器官中的累積，對精子形成抑制以及改變脂肪酸代謝從而對秀麗隱桿線蟲產生生殖毒性損害。

三、石墨烯的毒性作用機制

納米材料的性能和毒性與其物理和化學特性有關，如顆粒大小、結構、形狀、表面積、表面電荷、溶解度、催化活性、表面涂層和表面活性基團等[21，25]。小尺寸的GNMs允許它們穿過細胞膜和其他生物屏障進入生物體，造成細胞損傷。研究發現，石墨烯的表面積與氧化電位呈正相關，體積更小、表面積更大的石墨烯對大鼠的氧化應激和DNA損傷表現出更高的功效[26]。ROS的產生是納米材料最重要的毒性機制之一，可導致氧化應激、炎癥、脂質過氧化，并造成蛋白質、細胞膜和DNA的損傷[27]。

不同的研究報道了GO介導不同類型細胞自噬和壞死相關的多種信號通路的激活[28]；表觀遺傳調控機制包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色體重塑和小RNA調控已被報道可誘導納米毒性。在Sun等[27]的一項研究中，研究人員利用體外腎細胞系(HEK-293T)評估了GO使染色質結構改變的納米毒性，結果顯示其毒性的主要作用機制為激活了COX-2的高表達，從而促進炎癥反應的發生，破壞染色質結構。此外，在生殖細胞的研究中顯示，GNMs可以降低組織蛋白酶的數量和酶活性，抑制溶酶體蛋白水解能力，促進細胞凋亡；影響肌動蛋白帽的形成和第一極體排出，引起相關卵母細胞無法減數分裂，進而影響生殖活性[7，13]。

四、總結與展望

石墨烯是目前職業暴露較為廣泛的納米材料之一，由于其優異的理化特性而有廣泛的應用前景。研究表明，石墨烯通過不同的途徑進入生物體后，可以在生殖器官或組織中蓄積，引起各種組織生物損害，目前對石墨烯透過這類生物屏障的轉運機制的了解比較少。體外實驗表明，石墨烯暴露可以誘發生殖細胞的損傷；石墨烯在生殖細胞及組織內的蓄積和毒性與其粒徑、表面涂層、接觸的濃度和時間等因素相關；目前只有少數體內實驗研究表明石墨烯對小鼠生殖系統有影響，可能與石墨烯入體途徑有關，有待進一步研究。現有的資料表明，誘發細胞或組織內 ROS水平的升高是石墨烯造成細胞或系統毒性的主要原因。由于石墨烯的應用前景和潛在毒性，應該增多對石墨烯的生殖毒性研究，深入了解其在生殖系統的分布蓄積及其通過血睪屏障、胎盤屏障等生物屏障的轉運機制，同時進一步研究其對生殖系統的影響和毒性作用機制，為石墨烯生物醫用提供理論指導和依據。