小鼠神經系統中蛋白質降解通路調控分子的表達和分布

宋彬彬， 董文洲， 賈炳泉， 甄 然， 彭 宇， 楊 璇， 于 佳

（北京中醫藥大學附屬北京老年醫院，北京 100095）

蛋白質降解是細胞重要的生命活動，具有蛋白質量控制、清除細胞內錯誤折疊蛋白質、促進蛋白激活等作用。真核細胞內蛋白質降解通路主要有3種：泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）、自噬（autophagy）和鈣蛋白酶（Calpain）系統，三者降解底物或作用部位各有不同[1-2]，且受到多種分子的精細調控，包括UPS中的泛素（Ubiquitin），自噬通路中的組織蛋白酶D（Cathepsin D）、溶酶體關聯膜蛋白2（lysosomalassociated membrane protein 2，LAMP2)、自噬微管相關蛋白輕鏈3A/B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3A/B）、自噬相關蛋白3（autophagy-related protein 3，Atg3）和Ras相關GTP結合蛋白7（Ras-related GTP-binding protein 7，Rab7），以及Calpain途徑中的Calpain和鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。本實驗通過生物化學方法，以小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經和肌肉組織為材料，檢測C57BL/6J小鼠完整的神經信號轉導通路中蛋白質降解通路相關蛋白在不同組織、解剖部位和亞細胞結構（胞體和軸突）的表達和分布差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡野生型C57BL/6J小鼠，雄性4只，雌性1只，體質量16～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]，飼養于北京老年醫院屏障設施[SYXK(京)2019-0012]，根據實驗動物相關管理規定進行操作和處理。小鼠處死后迅速取眼（eye）、嗅球（olfactory bulb）、皮層（cortex）、海馬體（hippocampus）、紋狀體（striatum）、中腦（midbrain）、小腦（cerebellum）、腦干（brain stem）、脊髓（spinal cord，SC）、坐骨神經（sciatic nerve，SN）和肌肉（muscle），凍存于－80℃冰箱。動物實驗經本單位動物福利倫理委員會批準（2018BJLNYY-倫理-意見第2018-013號）。

1.2 主要試劑和儀器

10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液、蛋白酶抑制劑、PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒、蛋白質電泳預制膠和超聲波細胞破碎儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；10% TGX Acrylamide Kit、Turbo小型預制轉印包和Trans-Blot Turbo轉印系統均購自美國Bio-Rad公司；兔抗Calpain1大亞基（large）多克隆抗體、兔抗Calpastatin多克隆抗體、兔抗LC3A/B多克隆抗體和兔抗Atg3多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，大鼠抗LAMP2單克隆抗體、兔抗Ubiquitin單克隆抗體、鼠抗Rab7單克隆抗體和雞抗神經絲重鏈（neurofilamen heavy polypeptide，NFH）多克隆抗體均購自英國Abcam公司，鼠抗β-actin和Calpain小亞基（small）單克隆抗體均購自美國Sigma-Aldrich公司，山羊抗Cathepsin D多克隆抗體購自美國R&D Systems公司；熒光標記二抗和Odyssey CLX雙色紅外激光成像系統均購自美國LI-COR Bioscience公司。

1.3 蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平

速凍的小鼠組織稱質量后，按30 μL/mg加入 1% SDS裂解液，迅速剪碎，超聲破碎，室溫16 800 ×g離心10 min，收集上清液為總蛋白提取液。用BCA試劑盒測定蛋白含量，取各組等量蛋白提取液，經10% SDS-PAGE（Bio-Rad TGX acrylamide kit）或4%～12% NuPAGE Bis-Tris預制凝膠電泳分離，再將凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜放入5%脫脂牛乳中室溫封閉1 h或Odyssey封閉液中室溫封閉30min后，加入山羊抗Cathepsin D（1∶1 000）、大鼠抗LAMP2（1∶1 000）、兔抗LC3A/B（1∶1000）、兔抗Atg3（1∶1000）、鼠抗Rab7（1∶1 000）、兔抗Ubiquitin（1∶500）、兔抗Calpain1 large（1∶1 000）、鼠抗Calpain small（1∶500）、兔抗 Calpastatin（1∶1 000）、雞抗NFH（1∶5 000）、鼠抗β-actin（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜。PBST（含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液）漂洗3次（每次5 min）后，將膜放入熒光素IRDye標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG（1∶5 000）二抗中，室溫避光孵育1 h，PBST充分漂洗后，采用Odyssey凝膠成像系統檢測蛋白條帶的顯色情況，使用Image J軟件分析蛋白條帶的相對灰度。

1.4 統計學分析

使用統計軟件GraphPad Prism 7（美國GraphPad Software公司）進行分析。數據以表示，空間分布用柱形圖表示，兩組均數間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自噬和鈣蛋白酶途徑調控分子在小鼠神經系統中的分布

蛋白質印跡法檢測結果顯示，Cathepsin D、LAMP2、LC3A/B、Atg3、Rab7、Calpain大小亞基和Calpastatin在小鼠眼、嗅球、皮層、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、SC、SN和肌肉中都有一定表達（圖1A），但含量具有組織和解剖部位差異性（圖1B）。肌動蛋白β-actin為非肌肉型肌動蛋白，在神經系統中廣泛表達，在肌肉中不表達。

2.2 蛋白質降解調控分子在小鼠脊髓和坐骨神經中表達和分布

圖 1 蛋白質印跡法檢測自噬和鈣蛋白酶途徑調控分子在小鼠組織中表達Figure 1 Expression of autophagy and Calpain pathway molecules in the tissues of mice detected by Western blotting

圖 2 蛋白質印跡法檢測蛋白質降解通路調控分子在小鼠脊髓和坐骨神經中表達和分布Figure 2 Expression of protein degradation pathway molecules in the spinal cord and sciatic nerve of mice detected by Western blotting

蛋白質印跡法檢測結果顯示，蛋白質降解通路調控分子在小鼠SC和SN中有差異性表達（圖2A）。與SC相比，小鼠SN中UPS關鍵蛋白Ubiquitin和自噬通路中的Cathepsin D、LAMP2、總LC3A/B、Atg3、Rab7含量均明顯下降（P＜0.01），且未檢測到LC3A/B-Ⅱ蛋白；鈣蛋白酶途徑中的Calpain1 large總含量（包含全長相對分子量80 000和剪切型相對分子量75 000）明顯下降（P＜0.05），但剪切型Calpain1 large含量相對增加；而Calpain small總含量（包含全長相對分子量26 000和剪切型相對分子量18 000）明顯增加（P＜0.001），且剪切型Calpain small含量增加相對明顯；Calpastatin含量無明顯差異（P＞0.05）（圖2B）。

3 討論

UPS是高效、高度選擇的蛋白降解途徑，其廣泛參與機體多種代謝活動，主要降解短壽命蛋白質和應激條件下細胞內異常蛋白。UPS由Ubiquitin、泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）、泛素連接酶（E3）、蛋白酶體和去泛素化酶組成。在ATP作用下，Ubiquitin被活化后與E1結合，轉移到E2，再通過E3與靶蛋白結合，泛素化的靶蛋白進入26S蛋白酶體（ATP依賴性蛋白水解復合體）被降解為多肽或氨基酸。去泛素化酶可將Ubiquitin從底物上解離下來，繼續識別其他待降解蛋白質[3-4]。Pasquini等[5]早期研究提出，SN中不易形成泛素-蛋白質偶聯物。本研究發現，與SC相比，SN中Ubiquitin含量明顯減少，這可能使蛋白質泛素化過程受阻，從而引起軸突束中UPS降解蛋白質功能減弱。

自噬是真核細胞中廣泛存在的一種溶酶體依賴的降解途徑，較UPS具有更強的降解能力，可降解長壽命蛋白質（錯誤折疊蛋白、蛋白質復合物、積聚物）以及受損細胞器和細胞內病原體[6]。自噬過程分為3個階段：啟始、成熟和降解[7]。自噬起始復合物（ULK1、ULK2、ATG13、FIP200和ATG101）磷酸化后激活，活化的ULK1可以招募自噬相關蛋白（Atg）到自噬體形成位點，觸發自噬體形成[8]。前自噬體結構（pre-autophagosomal structure，PAS）初步延伸可包裹待降解物，隨后形成Atg5-Atg12-Atg16復合物，與3-磷酸磷脂酰肌醇結合且定位到自噬體膜上使膜延伸；或者Atg8經泛素樣酶Atg7和Atg3加工后，與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結合形成Atg8-PE，Atg8-PE位于自噬體膜，促進自噬體膜延伸和招募待降解物[9]。細胞質內Atg4家族蛋白還可以剪切LC3前體生成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ可通過Atg7和Atg3與PE偶聯后形成LC3Ⅱ，故LC3Ⅱ特異性與自噬體結合，LC3Ⅱ水平與自噬體數量正相關，可作為自噬體形成的標志物[10]。包裹待降解蛋白質或細胞器的自噬體（autophagosome）被運輸到溶酶體中被降解，且降解產物可供細胞再循環利用，以維護細胞內穩態。Cathepsin D是溶酶體中主要水解酶[11]。LAMPs是溶酶體膜上含量豐富的跨膜蛋白，LAMP1和LAMP2共占溶酶體膜蛋白的約80%，可維持溶酶體膜完整性[12]。LAMPs在溶酶體腔面的氨基末端高度糖基化，以防止溶酶體腔內酸性水解酶對其自身結構造成破壞[13]。細胞內吞形成內體，晚期內體也可攜帶特定待降解蛋白質，與溶酶體融合后進行降解。Rab7既位于晚期內體，也定位于自噬體，參與調控自噬體與溶酶體的結合，影響自噬體成熟和運輸[14]。本研究發現，與SC相比，SN中Cathepsin D、LAMP2、總LC3A/B、Atg3和Rab7含量均明顯減少，且未檢測到LC3A/B-Ⅱ。這說明自噬體和溶酶體主要分布在神經元胞體，軸突束中自噬體形成和溶酶體分布均相對減少。有研究發現，當SN受到損傷的早期，LC3-Ⅱ蛋白含量顯著增加，自噬水平提高可促進軸突、髓鞘再生和運動功能恢復[15-16]。

當細胞受損、刺激等引起細胞質中鈣離子水平升高時，Calpain被活化，發揮蛋白降解功能。Calpain可水解細胞骨架蛋白、膜相關蛋白、激酶和磷酸酶、轉錄因子和凋亡相關蛋白等百余種蛋白質，參與維護細胞結構、信號轉導、死亡等過程[17-18]。根據激活所需鈣離子濃度差異可將Calpain分為μ-Calpain（Calpain1）和m-Calpain（Calpain2），二者是哺乳動物普遍表達類型，均由具有催化活性的大亞基和具有調節活性的小亞基組成[19]。Calpain大亞基具有4個主要結構域：當Calpain大亞基被鈣離子激活后，結構域Ⅰ發生自溶，可暴露水解活性域；結構域Ⅱ是蛋白質水解的主要功能域，可分為Ⅱa和Ⅱb，鈣離子水平較低時，兩亞區域分離，抑制蛋白質水解；結構域Ⅲ為調節中心，參與Calpain膜轉移過程；結構域Ⅳ含有5個EF手性結構域，直接與鈣離子結合后，酶構象改變，大小亞基分離，逐步暴露水解活性結構域Ⅱa和Ⅱb，參與底物水解[20]。本研究中Calpain1 large抗體可檢測全長（相對分子量80 000）和28位亮氨酸自剪切后（相對分子量75 000）的Calpain1large蛋白。與SC相比，SN中總Calpain1large含量明顯減少，但剪切型Calpain1large蛋白（相對分子量75 000）含量相對增加。Calpain1和Calpain2具有相同的Calpain small，Calpain small為調節亞基，具有Ⅰ、Ⅱ兩個結構域，對于維持Calpain活性具有重要作用。本研究中Calpian small抗體可檢測全長（相對分子量26 000）和自溶剪切型（相對分子量18 000）Calpain small。研究發現，與SC相比，SN中總Calpain small含量明顯增加，且剪切型Calpain small含量增加相對明顯，提示Calpain small較活化。Calpain活性隨鈣離子濃度提高而增加，當Calpain過度活化時，Calpastatin可特異性抑制Calpain活性[21]。Baudry[22]研究提出，Calpain廣泛分布于機體各組織。本研究進一步發現，在神經系統中，SC與SN相比，Calpastatin含量無明顯差異；而SC和SN中Calpain大小亞基含量和活性具有明顯差異，提示Calpain調節的蛋白質降解主要發生在神經元軸突，較少發生于胞體。當SN受損時，軸突內鈣離子水平迅速升高可激活Calpain[23]，降解細胞骨架蛋白使軸突變性[24]，而Calpastatin對軸突和突觸結構及功能具有保護作用[25]。

蛋白質合成與降解平衡是維持細胞內穩態的重要條件，蛋白質降解通路受損引起蛋白質異常積聚可導致多種神經退行性疾病。本研究發現，與SC相比，小鼠SN中UPS和自噬通路相關蛋白含量明顯降低，而依賴于鈣離子的Calpain系統中Calpain small含量明顯增加，這提示UPS和自噬主要降解神經元胞體中蛋白質，而軸突束中主要通過Calpain途徑降解底物。在正常生理條件下，Calpain參與調節細胞遷移和軸突發育等；但在氧化應激、創傷、興奮毒性等病理條件下，鈣離子大量內流，Calpain高度活化，可能導致軸突變性、斷裂，甚至神經元死亡。蛋白質降解通路異常與疾病發生發展緊密相關，深入研究蛋白質降解通路及其關鍵分子可為神經系統疾病的治療提供新的思路。