60Co γ射線輻射對裸鼴鼠腎臟、肺臟以及骨骼肌的影響

張靜遠，張倩倩，趙懿寧，楊 蓉，張成財 ，賀辰囧，袁 征，崔淑芳#

（1. 海軍軍醫大學基礎醫學院實驗動物學教研室，上海 200433；2. 上海市楊浦區精神衛生中心醫技科，上海 200090；3. 軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心，北京 100071）

裸鼴鼠（naked mole rat）屬于哺乳綱嚙齒目豪豬亞目濱鼠科裸鼴鼠屬裸鼴鼠種，原產于非洲，以植物的根莖為食[1-2]。裸鼴鼠長期生活在地下2m的洞穴中，視力幾乎喪失，依靠身體與嘴兩側的觸毛感受周圍的環境。裸鼴鼠具有抗腫瘤、抗衰老、耐低氧及耐疼痛等特性，近年來已引起各國科研工作者的廣泛關注[3]。

電離輻射對生物體的影響是目前生物醫學研究領域的熱點之一。研究顯示，輻射能夠引發生物體多個組織的損傷，如γ射線輻射后ICR小鼠出現骨髓鐵沉積現象[4]；BALB/c小鼠胸腔輻射模擬可導致肺臟功能細胞大量壞死，肺臟嚴重纖維化[5]；7 Gy輻射C57BL/6J小鼠后，誘發原發性結腸炎癥及嚴重的功能障礙[6]。本課題組前期研究發現，裸鼴鼠在活體水平具有天然的輻射耐受能力[7]，腎臟、肺臟和骨骼肌作為機體內的重要器官和組織，在內環境穩定以及生命活動中發揮著重要作用。因此，本實驗以裸鼴鼠為研究對象，檢測輻射后腎臟、肺臟和骨骼肌的組織學變化，以及氧化應激指標變化，初步探討輻射對裸鼴鼠的影響，以期為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18月齡健康雄性裸鼴鼠21只，由海軍軍醫大學實驗動物中心生產，飼養于屏障設施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 實驗動物分組與實驗處理

21只裸鼴鼠隨機分為2組，分別為對照組7只和實驗組14只。實驗組裸鼴鼠給予全身一次性60Co γ射線輻射，輻射劑量率為1.163 Gy/min，輻射時間為8.6 min，總輻射劑量為10 Gy，由海軍軍醫大學輻照中心完成。

1.3 主要儀器設備及試劑

自動組織脫水機、包埋機、轉輪式切片機、染色機、封片機和倒置熒光顯微鏡等均購自徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司。生化檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 腎臟、肺臟和骨骼肌組織切片的制備與觀察 分別取對照組、輻射后7 d和14 d實驗組各3只裸鼴鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速取下腓腸肌，打開腹腔，取出腎臟、肺臟，置于通用型中性組織固定液中固定24 h。經脫水、透明、包埋、切片、染色、封固等步驟完成HE染色組織切片的制備，光學顯微鏡下觀察。

1.4.2 腎臟、肺臟和骨骼肌組織氧化應激指標檢測 分別取對照組、輻射后7 d和14 d實驗組各4只裸鼴鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速取下腓腸肌，打開腹腔，取出腎臟、肺臟。剪取0.1 g組織制備勻漿，經40 μm孔徑篩網研磨過濾后加入1 mL裂解液，12 000×g，4℃離心10min，取上清液用于檢測丙二醛（maleicdialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量，檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件進行分析處理。各實驗所得數據以x-±s表示，使用Graphpad Prism 5.0軟件對數據進行分析作圖。多組比較先進行方差分析，再采用Bonferroni法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學觀察

2.1.1 腎臟 光學顯微鏡下觀察發現，對照組腎臟細胞清晰完好，腎小球未見病變，基底膜完整（圖1A）。輻射后7 d及14d，鏡下可見腎臟細胞大小正常，未出現炎性反應和明顯的水腫、壞死等病變（圖1B、C）。

2.1.2 肺臟 光學顯微鏡下觀察發現，對照組裸鼴鼠肺臟組織肺泡結構清晰，肺泡大小正常（圖1D）。輻射后未出現肺泡腔滲出液和出血、成纖維細胞增生、肺組織局灶性實變等病變，但偶見肺泡間隔輕微增厚，少量炎性細胞浸潤（圖1E、F）。

2.1.3 骨骼肌 光學顯微鏡下觀察發現，對照組裸鼴鼠骨骼肌形態結構完整，肌纖維呈細條狀整齊平行排列（圖1G）。輻射后肌纖維呈圓形或多邊形，細胞核位于周邊；肌纖維相互平行排列，聚集成束，其周圍包有結締組織，即肌束膜；大小不等的肌束聚集在一起構成肌肉，其周圍包有致密的結締組織，即肌外膜；均未見肌纖維萎縮、壞死或者纖維化（圖1H、I）。

2.2 氧化應激指標檢測

2.2.1 腎臟 腎臟組織中MDA含量在輻射后7 d明顯高于對照組（P＜0.01），輻射后14d較對照組、輻射后7d有明顯升高（P＜0.01）。T-AOC與GSSG含量在輻射后未見明顯變化。GSH含量在輻射后7 d較對照組明顯升高（P＜0.05），輻射后14 d較對照組、輻射后7 d明顯降低（P＜0.05）（表 1）。

圖 1 60Co γ輻射后不同時間裸鼴鼠腎臟（A～C）、肺臟（D～F）、骨骼?。℅～I）組織學觀察Figure 1 Histopathological observation on the kidney (A-C), lung (D-F) and skeletal muscle (G-I) tissues of naked mole rats at different time points after 60Co γ radiation

2.2.2 肺臟 肺臟組織中的MDA含量在輻射后7 d明顯高于對照組（P＜0.05），輻射后14d較對照組、輻射后7 d有明顯升高（P＜0.005）。T-AOC在輻射后7 d、輻射后14 d均低于對照組（P＜0.005，P＜0.01）。GSH含量在輻射后7d與對照組相比明顯降低（P＜0.005），輻射后14 d較對照組、輻射后7d有顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。GSSG含量在輻射后7 d與對照組相比明顯降低（P＜0.05），輻射后14 d較對照組、輻射后7d有明顯升高（P＜0.01）（表1）。2.2.3 骨骼肌 骨骼肌中MDA含量在輻射后7 d明顯高于對照組（P＜0.01），輻射后14d明顯低于輻射后7 d（P＜0.01），但仍明顯高于對照組（P＜0.01）。T-AOC在輻射后7 d和14 d均明顯低于對照組（P＜0.01）。GSH和GSSG含量在輻射后7d與對照組相比明顯降低（P＜0.01），輻射后14 d均明顯高于對照組、輻射后7 d（P＜0.01）（表 1）。

表 1 60Co γ射線輻射對裸鼴鼠腎臟、肺臟、骨骼肌氧化應激指標的影響Table 1 Effects of 60Co γ-ray radiation on indicators of oxidative stress in kidney, lung and skeletal muscle of naked mole rats

3 討論

在人類生存環境中，輻射無處不在，除天然輻射外，工業核污染、醫療放射以及日常生活中的電器輻射，均可對人類造成不同程度的輻射損傷[8-9]。其中，天然輻射和醫療放射是造成人類輻射損傷的主要輻射來源，當輻射達到一定劑量，會產生急性放射病，導致器官損傷，細胞癌變概率增加[10]。因此，開展輻射損傷防治研究具有重要的現實意義。

目前輻射相關的研究主要圍繞小鼠、大鼠和小型豬等。王敏等[11]研究發現，昆明小鼠在受到5 Gy X 射線全身輻射后，會發生腎小球腫脹，腎小管和集合管上皮細胞空泡化、凋亡、壞死。周中林等[12]研究發現，C57BL/6小鼠在受到6 Gy60Co γ一次性全身輻射后，肺組織網狀結構不清晰，肺泡間隔斷裂，部分肺泡融合。陳超等[7]研究發現，小鼠在經少量多次輻射之后，骨組織骨髓腔內紅骨髓減少，間質細胞炎性浸潤。在本研究中，裸鼴鼠經過60Co γ射線10 Gy一次性全身輻射后，鏡下可見腎臟細胞大小正常，未出現炎性反應以及明顯的腫脹、凋亡、壞死等病變；肺臟組織肺泡結構清晰，肺泡大小正常，僅偶見肺泡間隔輕微增厚，有少量炎性細胞浸潤，未出現肺泡腔滲出液和出血、成纖維細胞增生、肺組織局灶性實變等病變；未觀察到骨骼肌纖維萎縮、壞死和纖維化，間質細胞炎性浸潤等變化。結果表明輻射對裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌影響較小，提示受到輻射刺激后的裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌仍然能夠維持良好的穩定性。與小鼠以及其他實驗動物構建的輻射損傷模型相比，裸鼴鼠這一獨特的生物學特性或可為后期輻射損傷防治研究提供參考。

輻射損傷效應除表現在組織學，還表現在分子水平上，主要表現為化學鍵破壞誘發的水分子、DNA、蛋白質等電離。水分子在電離時可產生活性氧簇和活性氮自由基，改變細胞正常氧化過程而損害健康[13-14]。脂質過氧化的終產物MDA是機體受到氧化損傷的重要標志[15]。本研究中輻射后裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌中MDA含量均明顯升高（P＜0.01），表明氧化自由基在裸鼴鼠體內迅速積累，發生明顯的氧化應激反應。GSSG和GSH是機體內重要的抗氧化和自由基清除劑，正常情況下機體以GSH形式存在為主，GSH含量是衡量機體抗氧化能力大小的重要指標[16-17]。輻射后裸鼴鼠肺臟、骨骼肌中GSH和GSSH水平在7 d時出現明顯降低，提示抗氧化物質消耗；但與小鼠的情況[18]不同的是，裸鼴鼠GSH和GSSH水平在輻射后14 d出現明顯回升，表明裸鼴鼠可能在受到氧化應激損傷后，通過提高體內抗氧化產物表達水平來提高裸鼴鼠耐受輻射的能力。裸鼴鼠腎臟GSH水平在輻射后7 d時顯著增高，14 d顯著下降；GSSG沒有發生顯著變化，較肺臟和骨骼肌而言，裸鼴鼠腎臟能迅速提高抗氧化能力來抵抗氧化損傷。T-AOC反映的是機體總體的抗氧化能力，其數值的高低反映機體抗氧化能力的強弱[16]。與對照組相比，輻射后裸鼴鼠腎臟T-AOC在沒有明顯變化，肺臟T-AOC在輻射7 d后水平明顯降低，但在14 d已經回升并接近對照組，骨骼肌T-AOC在14 d仍然維持7 d水平，提示裸鼴鼠機體有較強的抗氧化能力恢復力，幫助機體抵抗輻射損傷。

綜上所述，輻射后裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌發生明顯的氧化應激反應，但在組織學觀察時并未發現相應的病理損傷。一方面表明裸鼴鼠對輻射具有一定程度的耐受能力，另一方面也表明裸鼴鼠體內還存在其他尚未明確的過氧化清除機制，這為后續研究裸鼴鼠耐輻射機制奠定了基礎。