基于網絡藥理學探究白藜蘆醇抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的分子機制

張曉節(jié)，蔣 磊

（安徽省第二人民醫(yī)院藥學部，合肥 230041）

急性心肌梗死是冠狀動脈急性或持續(xù)性缺血缺氧導致心肌組織壞死。心肌細胞大量死亡，嚴重影響患者的預后。心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）損傷是指心肌短時間內供血不足或停止，之后又恢復供血，進而造成心肌組織損傷的過程[1]。研究表明，導致MI/R損傷的機制包括細胞壞死、細胞凋亡、鈣超載，以及過量氧自由基的產生等[2-4]。目前，治療MI/R損傷的有效藥物尚不完全明確。

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是存在于桑樹、花生或朝鮮槐等多種植物中的一種非黃酮類多酚化合物。既往研究證實，RSV能夠通過減少MI/R損傷、舒緩血管或者抗動脈粥樣硬化等途徑發(fā)揮保護心血管系統(tǒng)的作用[5-6]。然而，有關RSV治療MI/R損傷的具體分子機制尚不清楚。網絡藥理學是基于整體構想，通過構建多層次的復雜網絡，發(fā)現(xiàn)關鍵節(jié)點即關鍵靶基因，然后以此對疾病的發(fā)病機制和藥物干預作用機制進行有效預測。

本研究采用網絡藥理學信息篩選方法，從RSV治療MI/R損傷的整體分子作用角度出發(fā)，探尋RSV治療的有效靶基因，然后通過動物體內實驗驗證RSV治療MI/R損傷的分子機制，為RSV應用于臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，體質量為（200±20）g，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK（皖）2017-001]。所有大鼠在25 ℃左右、相對濕度為40%～70%的環(huán)境[SYXK（皖）2017-004]中適應性飼養(yǎng)7 d，然后進行動物實驗。本實驗方案通過安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會審核批準（IACUC：20170625006）

1.2 藥物與試劑

RSV粉末（純度高于99%）和戊巴比妥鈉（批號：57-33-0）均購自美國Sigma公司；蛋白質印跡法檢測用兔抗caspase-3單克隆抗體（#9662）和小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（#3498）均購自美國Cell Signaling Technology公司，小鼠抗腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）單克隆抗體（15497-1-AP）購自中國武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗GAPDH單克隆抗體（AF5009）、一抗稀釋液、二抗稀釋液、HE染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗TRAIL一抗免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。大鼠血漿中乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）含量測定用試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3 RSV與MI/R損傷靶基因篩選及調控網絡圖構建

通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫（https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選得到RSV有效作用靶基因，然后采用GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）篩選得到MI/R損傷相關靶基因。最后運用R語言軟件包中的VennDiagram程序包，對RSV作用與MI/R損傷相關的靶基因取交集，再利用Cytoscape軟件（https://cytoscape.org/），導入這些交集基因，構建基因調控網絡。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

運用R語言軟件包中的String和Colorspace程序包，對基因調控網絡進行GO功能富集分析，并畫出關鍵基因的富集分析柱狀圖及氣泡圖。使用模糊聚類算法，以注釋共同度為基礎，對基因進行聚類計算，得出聚類分值，該分值代表該基因在基因調控網絡中的重要性。然后根據GO富集分析結果，運用R語言軟件包中的Bioconductor程序包，進行KEGG通路分析，得到RSV治療MI/R損傷涉及的主要信號通路。采用超幾何分布設計法進行KEGG富集分析，富集分析的顯著性按照Benjamini-Hochberg校正法進行計算。

1.5 動物建模與分組

實驗大鼠隨機分為3組，即假手術組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MI/R組）及藥物治療組（RSV組），每組各10只。采用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，大鼠四肢通過肢體導聯(lián)針與呼吸機連接，記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖，分離左側冠狀動脈。Sham組只穿線不結扎左冠狀動脈前降支；MI/R組和RSV組結扎左冠狀動脈前降支約40 min，然后松開結扎線再灌注2 h。在整個過程中，以缺血時心肌組織變白且心電圖ST段抬高，再灌注時心肌變紅且ST段下降，視為造模成功。RSV組大鼠于舌下靜脈滴注用生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）配制的RSV溶液（10 mg/kg），而Sham組和MI/R組均注射等量的生理鹽水。

1.6 血漿中 LDH、CK和cTnⅠ含量測定

對各組大鼠心臟取血，并將收取的血液放置于抗凝離心管內，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上清液。按照試劑盒操作說明書檢測大鼠血漿中LDH、CK和cTnⅠ的含量，酶標儀測定吸光度值，以此反映大鼠MI/R損傷后的心肌功能。

1.7 大鼠心肌梗死面積檢測

頸椎脫臼法處死大鼠，取各組大鼠心臟。垂直心臟長軸，順心尖向底部的方向將心臟組織切片，切片厚度為5μm。將切片置于37 ℃、pH為7.4的TTC溶液中染色10 min，然后用4%的多聚甲醛溶液固定。缺血心肌組織呈現(xiàn)白色，正常的心肌組織為血紅色，心肌梗死面積相對百分比＝白色區(qū)域面積/血紅色區(qū)域面積×100%。

1.8 HE染色觀察心肌結構

取大鼠心肌組織，用4%的多聚甲醛溶液進行固定，再用不同體積分數的乙醇溶液梯度脫水，然后用二甲苯進行組織透明，最后經石蠟包埋，切片。使用HE染色試劑盒，根據試劑盒操作說明進行HE染色。光學顯微鏡下觀察心肌組織結構。

1.9 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內脫蠟，然后使用二甲苯浸洗2次，每次約5 min。之后用梯度乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）清洗各1次，每次約3 min。采用Proteinase K工作液處理心肌組織切片20 min，并在室溫條件下加入細胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反應混合液，反應30 min。切片風干后，加入50 μL的 Converter-POD，加上蓋玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞數目并拍照。細胞凋亡率（%）＝TUNEL陽性細胞數目/細胞總數目×100%。

1.10 免疫組織化學法檢測TRAIL蛋白表達

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內脫蠟，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脫水。將心肌組織切片置于10 nmol/L的檸檬酸鹽緩沖液中，90 ℃抗原修復30 min。室溫條件下，自然冷卻并用去離子水緩慢沖洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封閉20 min。加入小鼠抗TRAIL單克隆抗體（工作液體積稀釋比例為1∶200），4℃條件下孵育過夜。加入山羊抗小鼠二抗，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯色后拍照，觀察心肌組織中TRAIL蛋白表達情況。

1.11 蛋白質印跡法檢測caspase-3、Bcl-2和TRAIL表達

取大鼠心肌組織，PBS潤洗1～2次，加入細胞組織裂解液（體積比為1∶5），冰上裂解1 h；4℃，12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進行蛋白質定量檢測；然后取心肌細胞總蛋白30μg，上樣至聚丙烯酰胺凝膠，80 V電泳30 min后，轉120 V電泳60 min，溴酚藍指示電泳至凝膠最底層。依據蛋白質指示marker和目的蛋白分子量大小，切取目的膠條，采用濕轉法將目的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜時長2h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗TRAIL單克隆抗體（1∶1 000）和兔抗GAPDH（1∶5 000）單克隆抗體，4℃孵育過夜；再加入對應的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h；搖床上加入TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。結果以各目的條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.12 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計結果分析。動物體內實驗檢測均獨立重復3次，結果數據用表示，多組間比較采用單因素方差分析方法，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RSV作用與MI/R損傷靶基因交集及其調控網絡

通過對RSV作用的128個藥效靶基因和MI/R損傷的1 231個基因靶點進行基因交集篩選，得到86個可能與RSV治療MI/R損傷相關的基因作用靶點（圖1A），其中包括PTGS1、PTGS2、MAOB、RELA、STAT3、AKT1、VEGFA、CCND1、Bcl-2、Bcl-2-L1和caspase-3等。然后通過Cytoscape軟件成功構建RSV治療MI/R損傷的相關基因調控網絡，如圖1B所示。

圖 1 RSV作用靶點和MI/R損傷相關基因的交集篩選圖（A）及其調控網絡圖（B）Figure 1 Intersection screening diagram (A) and regulation network diagram (B) of resveratrol (RSV) target genes and myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) damage-related genes

2.2 相關靶基因的GO富集功能與KEGG富集信號通路

GO富集分析可得到特定功能層次上由基因或蛋白數目構成的有向無環(huán)圖，其中包括分子功能、細胞組分及生物過程3個方面。如圖2A所示，篩選得到的86個相關基因主要富集在細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、抑制轉錄因子結合（repressing transcription factor binding）和激活轉錄因子結合（activating transcription factor binding）等功能。

采用R語言軟件包對篩選得到的86個靶基因進行KEGG信號通路富集分析。結果顯示共有157條信號通路，涉及參與糖尿病并發(fā)癥調控的AGE-RAGE信號通路、卡波肉瘤相關性皰疹病毒感染通路和細胞凋亡信號通路（圖2B）。其中細胞凋亡信號通路涉及的主要基因包括TRAIL、caspase-3、Bcl-2及Bax等（圖2C）。

2.3 RSV對大鼠心肌功能的影響

如表1顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠的血漿中LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯增加（P＜0.01），心肌梗死面積也明顯增大（P＜0.01）；而相比于MI/R組，在給予RSV藥物干預后，大鼠心肌功能得到明顯改善，血漿LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯降低（P＜0.01），心肌梗死面積明顯減少（P＜0.05）。

2.4 RSV對大鼠心肌結構的影響

HE染色結果顯示：Sham組心肌結構正常；MI/R組大鼠的心肌纖維排列紊亂，且部分肌絲斷裂，間隙增寬；相比于MI/R組，RSV組大鼠的心肌纖維排列較為規(guī)則，心肌間隙變小，心肌細胞變形恢復較好（圖3）。

2.5 RSV對大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果（圖4）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯升高（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。蛋白質印跡法檢測結果（圖5）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌組織中caspase-3表達明顯上調（P＜0.05），而Bcl-2表達明顯下調（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌組織中caspase-3表達明顯下調（P＜0.05），而Bcl-2表達量明顯增加（P＜0.05）。

圖 2 關鍵靶向基因的GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）柱狀圖以及細胞凋亡信號通路圖（C）Figure 2 GO enrichment analysis (A) and KEGG enrichment analysis (B) histogram of key target genes and their related apoptosis signaling pathways (C)

表 1 RSV對MI/R大鼠心肌功能的影響Table 1 The effect of resveratrol (RSV) on the myocardial function of myocardial ischemia-reperfusion(MI/R) damaged rats(x- ± s, n=6)

圖 3 HE染色檢測大鼠心肌組織形態(tài)學變化Figure 3 Morphological changes of rat myocardium tissues after HE staining

圖 4 TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡（×200）Figure 4 Apoptosis of rat cardiomyocytes after TUNEL staining (×200)

圖 5 蛋白質印跡法檢測RSV對心肌組織中凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of resveratrol (RSV) on the expressions of apoptosis-related proteins in rat myocardium by Western blotting

2.6 RSV對TRAIL蛋白表達的影響

免疫組織化學法檢測結果（圖6A）顯示：MI/R組大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達量增加，而給予RSV藥物處理后TRAIL表達水平降低。蛋白質印跡法檢測結果（圖6B）顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；相比于MI/R組，RSV組TRAIL蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。

圖 6 RSV對大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達的影響Figure 6 Effects of resveratrol (RSV) on the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) protein in rat myocardium

3 討論

RSV是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于多種植物中，具有抗心血管疾病和抗腫瘤等多種生物活性。以往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠MI/R損傷模型中，RSV能有效縮短室性心動過速及室顫發(fā)生的持續(xù)時間，改善心肌損傷[7]。另外，RSV也能夠通過抗氧化、抗自由基作用，減少心肌細胞壞死[8]。RSV還能通過調控一氧化氮合酶/一氧化氮（NO）通路，促進NO釋放，發(fā)揮對MI/R損傷的保護作用[9]。

已知氧化應激在MI/R損傷中扮演重要作用。有文獻顯示，在MI/R損傷大鼠模型中，心肌細胞線粒體功能出現(xiàn)嚴重損傷，活性氧產生量異常增加，導致心肌梗死面積增大；而用RSV預處理MI/R損傷模型大鼠后，心肌細胞線粒體功能得到明顯改善[10]。同時，炎性反應是MI/R損傷的重要病理生理學機制[11]。在MI/R損傷的大鼠模型中炎性細胞因子水平顯著升高，而給予RSV處理后上述炎性細胞因子水平明顯降低，提示通過早期的RSV處理抑制炎性反應，能夠有效地減輕MI/R損傷[12]。

在上述文獻研究的基礎上，本研究通過網絡藥理學預測RSV治療MI/R損傷的關鍵靶基因。結果發(fā)現(xiàn)：用TCMSP數據庫篩選得到RSV作用有效基因靶點共128個，用GeneCards篩選得到MI/R損傷相關靶基因共1 231個，兩者交集后共有86個可能成為RSV治療MI/R損傷的相關基因，其中包括Bcl-2、caspase-3和TRAIL等。以往研究表明，RSV能夠通過抑制caspase-3活性，促進Bcl-2蛋白表達，進而降低心肌細胞凋亡率，減輕MI/R損傷[13-14]。本研究進一步采用Cytoscape軟件成功構建了RSV治療MI/R損傷的基因調控網絡拓撲圖，涉及86個關鍵靶基因。通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，關鍵靶基因主要富集在細胞因子受體結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合和抑制轉錄因子結合等生物學功能，而KEGG通路富集共涉及157條信號通路，其中排在前3位的是參與糖尿病并發(fā)癥調控的AGE-RAGE信號通路（29/86）、卡波肉瘤相關性皰疹病毒感染通路（26/23）和細胞凋亡信號通路（23/86）。而在細胞凋亡信號通路中涉及23個基因，包括TRAIL、caspase-3和Bcl-2等基因。因此，本研究進一步通過大鼠體內實驗驗證RSV治療MI/R損傷可能與細胞凋亡通路及這3個基因表達有關。

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族成員之一，通過與其不同的受體結合，參與調控細胞增殖、凋亡和炎性反應等病理生理學過程[15-16]。有文獻顯示，在胰腺癌細胞系（SW1990、PaTu8988和BxPC3）中，過表達TRAIL能夠上調TRAIL受體1和2的表達，促進腫瘤細胞凋亡[17]；在急性淋巴細胞白血病細胞株中，體外聯(lián)合枸杞多糖和TRAIL能夠激活caspase-3活性，增加腫瘤細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性[18]。以上研究結果共同表明，TRAIL在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是有關TRAIL對MI/R損傷引起心肌細胞凋亡的作用尚未見報道。因此，筆者基于前期的網絡藥理學分析結果推測，RSV可能通過調控TRAIL表達，逆轉MI/R損傷。因此，本課題組構建了MI/R損傷大鼠模型，探究RSV能否通過抑制TRAIL表達，降低心肌細胞凋亡，進而減輕心肌損傷。HE染色結果顯示，與MI/R組大鼠相比，RSV組大鼠心肌纖維排列規(guī)則，心肌間隙變小。TUNEL染色結果顯示，心肌細胞凋亡率顯著降低。進一步通過蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白表達，結果發(fā)現(xiàn)與MI/R組相比，RSV組caspase-3表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高。為明確RSV能否通過調控TRAIL表達來抑制細胞凋亡，本研究采用免疫組織化學法和蛋白質印跡法檢測TRAIL蛋白表達，結果顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL表達量顯著增加，而RSV處理后TRAIL表達水平顯著降低。以上結果表明，RSV能夠通過調控TRAIL表達抑制MI/R心肌細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學預測以及大鼠體內實驗驗證發(fā)現(xiàn)，RSV能夠抑制TRAIL蛋白表達，降低心肌細胞凋亡，進而減輕MI/R損傷；這為今后應用RSV治療MI/R損傷提供了新的理論基礎。