PCA-決策樹模型評價miR-30a與RPR、AAR、FIB-4、APRI在乙肝患者肝纖維化的應用價值

張明, 祝再然, 趙桂金, 董嘉良

天津市寧河區醫院 1檢驗科， 2內分泌科(天津 301500)

乙型肝炎(hepatitis B，乙肝)在我國具有較高的發病率，是導致肝硬化和肝癌的原發性疾病，肝纖維化是其惡化的必經過程。動物實驗[1]顯示，及時有效的藥物治療能夠逆轉肝纖維化進程，從而恢復肝臟的正常組織結構。因此，乙肝患者肝纖維化的準確診斷和疾病嚴重程度的有效預測，對于抗纖維化的治療、改善預后具有重要價值。肝臟活檢是肝纖維化診斷的金標準，但有創、不能實時監測，難以滿足動態監測需求[2]。目前，臨床迫切需要快速、無創、準確且可重復的肝纖維化診斷指標，以便于疾病診斷、病情評估和抗纖維化的療效評價。紅細胞體積分布寬度與血小板比值(red cell volume distribution width-platelet ratio，RPR)模型、天冬氨酸/丙氨酸氨基轉移酶比率(aspartate to alanine aminotransferase ratio,AAR)、FIB-4(Fibrosis-4)、天冬氨酸氨基轉移酶/血小板比值指數(Aspartate aminotransferase/platelet ratio index，APRI)是國內外眾多學者提出的肝纖維化無創診斷的代表性模型，診斷效能好，但仍缺乏精準性[3]。近年來研究顯示，多指標聯用有助于提高診斷的準確性。隨著研究的深入，人們發現miRNA與肝纖維化有關。miR-30a能夠通過逆轉肝星狀細胞活化來抑制腹膜和心肌纖維化進程，在肝纖維化患者中低表達[4]。本研究采用主成分分析(principal component analysis，PCA)-決策樹模型評價miR-30a與RPR、AAR、FIB-4、APRI在乙肝患者肝纖維化的診斷和預測疾病嚴重程度中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院于2017年1月至2019年6月收治的875例肝病患者作為研究對象，男463例，女412例，年齡19～57歲，平均(38.5±6.5)歲，病程0.5～10年，平均(5.2±1.6)年，肝癌423例，肝良性病變(包括肝臟血管性疾病、代謝性疾病、病毒性肝炎、肝臟良性實質病變、酒精性肝病、肝膿腫和肝臟肉芽腫)293例，肝纖維化89例，膽結石70例。依據是否合并乙肝將患者分為乙肝組和非乙肝組，乙肝組226例，男120例，女106例，年齡19～57歲，平均(38.1±6.7)歲，病程0.5～10年，平均(5.1±1.5)年，肝癌140例，肝良性病變(包括肝臟血管性疾病、代謝性疾病、病毒性肝炎、肝臟良性實質病變、酒精性肝病、肝膿腫和肝臟肉芽腫)37例，肝纖維化39例，膽結石10例；非乙肝組649例，男343例，女306例，年齡19～57歲，平均(38.6±6.4)歲，病程0.5～10年，平均(5.3±1.6)年，肝癌283例，肝良性病變(包括肝臟血管性疾病、代謝性疾病、病毒性肝炎、肝臟良性實質病變、酒精性肝病、肝膿腫和肝臟肉芽腫)256例，肝纖維化50例，膽結石60例，兩組性別、年齡、病程差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，兩組疾病構成差異有統計學意義(2=58.223，P=0.000)。

1.2 納入標準 (1)符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年修訂)[5]和《中國肝病診療管理規范》[6]；(2)性別年齡不限；(3)腫瘤分級和分期不限；(4)無既往腫瘤病史；(5)自愿參與本研究，簽署知情同意書，在知情同意的基礎上進行肝臟活檢；(6)本研究入選患者均獲得倫理委員會批準。

1.3 排除標準 (1)肝臟活檢失敗，未明確病理診斷；(2)合并原發性肝癌、肝移植、自身免疫性肝病及遺傳性肝病患者；(3)合并慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、血液系統疾病、腎功能衰竭及其他惡性腫瘤者；(4)合并免疫缺陷病毒感染者；(5)入組前1周使用影響新陳代謝和凝血機制藥物，或進行透析、使用血液制品患者，或1年內經抗病毒或抗纖維化治療者；(6)合并嚴重心肺疾病。

1.4 方法

1.4.1 血清學指標測定 所有研究對象于肝穿刺前1周取空腹肘靜脈血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-40℃保存，檢查血常規、血清生化指標和凝血酶原時間，測定血清miR-30a水平。血常規指標采用全血自動分析儀測定，凝血酶原時間采用血凝儀測定，血脂、肝腎指標采用全自動生化分析儀(型號：HITACHI 7600-020型)檢測，透明質酸采用化學發光法檢測，HBV血清標志物采用全自動化學發光免疫分析儀(型號：A RCHITECT i2000 SR)。所有檢測由檢驗專業人員按說明書操作進行。

1.4.2 RPR、AAR、FIB-4、APRI計算 RPR=紅細胞分布寬度/血小板；AAR=天冬氨酸轉移酶/丙氨酸氨基轉移酶；FIB-4=(年齡×天門冬氨酸氨基轉移酶)/(血小板×丙氨酸氨基轉移酶2)；APRI=天門冬氨酸氨基轉移酶相對其正常上限值的倍數×100/血小板。

1.4.3 肝纖維化分級 超聲引導下肝臟穿刺，取肝臟組織(≥15 mm)，10%甲醛溶液固定，常規石蠟切片，病理醫生閱片，按Metavir病理組織學肝纖維化分級標準分為F0～F4級，F0級為無纖維化，F1級為無纖維間隔，匯管區纖維性擴大，F2級為有少數纖維間隔及匯管區纖維性擴大，F3級為無硬化結節，但有大量纖維間隔；F4級為肝硬化。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料以率表示，采用2檢驗比較，計量資料以表示，采用t檢驗比較，ROC曲線評價診斷效能，相關性分析采用Spearman雙變量相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組肝臟疾病患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比較 肝癌、肝良性病變、肝纖維化、膽結石患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比較差異有統計學意義(P<0.05)，組間兩兩比較，肝纖維化組RPR、FIB-4、APRI高于其余組(P<0.05)，AAR、miR-30a低于其余組(P<0.05)。見表1。

表1 4組肝臟疾病患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比較

2.2 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a與肝臟疾病的相關性分析 miR-30a與肝癌、肝良性病變、肝纖維化和膽結石相關性有統計學意義(P<0.005)，其中與肝纖維化的相關性最高；AAR、RPR與肝癌、肝良性病變和肝纖維化相關性有統計學意義(P<0.005)，其中與肝纖維化的相關性最高；APRI、FIB-4與肝良性病變和肝纖維化相關性有統計學意義(P<0.005)，其中與肝纖維化的相關性最高。見表2。

表2 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a與肝臟疾病的相關性分析

2.3 乙肝纖維化組與非乙肝纖維化組RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比較 乙肝纖維化組RPR、FIB-4、APRI高于非乙肝纖維化組，AAR、miR-30a低于非乙肝纖維化組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 乙肝纖維化組與非乙肝纖維化組各項指標比較

2.4 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a診斷乙肝纖維化的ROC曲線分析 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a診斷乙肝纖維化的ROC曲線下面積(AUC)>0.75，依次為miR-30a>RPR>AAR>APRI>FIB-4，診斷敏感度為71.7%～82.6%，特異度為72.0%～89.0%，診斷效果良好。見表4和圖1。

表4 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a診斷乙肝纖維化的效果

圖1 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a診斷乙肝纖維化的ROC曲線分析

2.5 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a與乙肝纖維化分級的相關性分析 乙肝纖維化分級與RPR、FIB-4、APRI呈正相關，與AAR、miR-30a呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a與乙肝纖維化的相關性分析

2.6 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a的PCA分析 以RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a五項指標提取主成分，按特征值>1提取第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)，PC1含的信息量最大，已含信息量不在出現PC2中。兩者解釋了原有數據72.1%的綜合信息，主成分方程為：PC1=0.482miR-30a+0.412PRP+0.395AAR+0.127APRI+0.043FIB-4；PC2=-0.045miR-30a-0.027PRP-0.052AAR+0.548APRI+0.593FIB-4；PC1和PC2診斷乙肝纖維化的敏感度為71.8%、76.9%，特異度均為93.4%，AUC分別為0.722、0.731，表明兩者診斷乙肝纖維化效果相當。

2.7 基于5項指標單項和聯合的兩種決策樹模型比較 隨機選取70.0%為訓練集，剩余30%為檢測集沒建立單項指標決策樹模型，單項指標中僅miR-30a進入決策樹模型(2=45.034，P=0.000)；以PC1和PC2聯合建立PCA-決策樹模型，按兩種模型對乙肝纖維化預測準確率進行比較，數據顯示，單項決策樹模型、PCA-決策樹模型對乙肝纖維化的診斷準確度分別為85.3%、92.1%，預測準確度為88.5%、93.4%。

3 討論

RPR、AAR、FIB-4、APRI是基于乙肝建立的乙肝纖維化診斷的無創模型，最新研究拓展了各模型在非酒精性脂肪性纖維化、丙肝性纖維化中的應用[7]。為進一步探討各模型與乙肝纖維化的相關性，本研究納入了膽結石、肝良性病變、肝癌等肝臟疾病，同時引入參與調節肝纖維化發展的miR-30a，采用PCA-決策樹模型評價，以期提高乙肝纖維化的診斷和預測效能。

不同肝臟疾病患者各項指標比較顯示，肝癌、肝良性病變、肝纖維化、膽結石患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比較差異有統計學意義(P<0.05)，RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a與肝臟疾病存在相關性，其中與肝纖維化的相關性最佳。近年來部分文獻[8]報道顯示PRP診斷非乙肝性肝纖維化效能較好，與本研究結果大致吻合。miR-30a能夠抑制腹膜纖維化和心肌纖維化的發生和發展，在肝癌和乙肝纖維化患者中低表達，因而呈負相關。

乙肝纖維化與非乙肝纖維化患者各項指標統計學分析顯示，無創模型、miR-30a與乙肝纖維化密切相關，不同于其他肝臟疾病。各項指標在乙肝纖維化患者中異常，乙肝纖維化分級與RPR、FIB-4、APRI呈正相關，與AAR、miR-30a呈負相關，表明各指標與乙肝纖維化嚴重程度相關，能夠反映患者病情。ROC曲線顯示，各指標診斷乙肝纖維化的敏感度為71.7%～82.6%，特異度為72.0%～89.0%，AUC>0.75，診斷效果良好。各指標診斷的AUC依次為miR-30a>RPR>AAR>APRI>FIB-4，提示miR-30a、RPR診斷的效能優于其他指標。AAR、APRI、FIB-4是乙肝纖維化診斷的常規模型，具有中等敏感度和準確度，但不能完全替代肝臟活檢。其中AAR模型用于乙肝纖維化分期評估存在爭議，部分研究者認為可準確評估纖維化分期，部分研究者認為對嚴重肝纖維化基本無診斷價值[9]。RPR不同于其他模型，其選RDW而非酶類，RDW在乙肝纖維化患者中特異性異常，因而診斷乙肝纖維化的穩定性較好。據報道[10]，RDW每增加1%，纖維化發生的風險增高12.1%。研究[11]顯示乙肝纖維化患者RPR高于非乙肝纖維化，本研究結果與之相符。亦有文獻[12]顯示，乙肝纖維化分級與RPR模型呈正相關，但缺乏精準性。總之，RPR與乙肝纖維化存在相關性，但尚未形成共識。miR-30a是具有調控功能的內源性小分子非編碼RNA，從miRNA水平調節靶基因的表達，進而參與生命活動。研究發現，miR-30a在乙肝、肝硬化、肝良性疾病中差異化表達[13]，目前，miR-30a差異性表達已逐漸用于乙肝細纖維化的診斷[14]，有望成為新的診斷標志物。本研究中miR-30a診斷乙肝纖維化的AUC為0.892，診斷準確性較好。在單項決策樹模型中，僅miR-30a進入模型，證實了miR-30a在乙肝纖維化診斷中的價值。

鑒于乙肝纖維化診斷指標RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a等較多，且各有局限性，因而臨床建議聯合多項指標，以提高診斷效能、療效和復發預測。PCA-決策樹分析時采用概率的原理將多個變量間的相互作用以樹形圖的方式呈現，并采用降維的方法對數據進行抽取構建的分類預測多參數模型，不影響數據的穩定性和準確性，具有直觀、減少主觀性等優點。該法在保留絕大部分數據信息的情況下提取幾個指標代替原指標，將多指標歸結為2～3個主成分，化繁為簡，得到的結果也更加科學有效[15]。目前，PCA-決策樹模型已用于胃癌的鑒別和診斷[16]。本研究應用PCA-決策樹模型將RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a五個指標提取2個主成分，解釋了原有數據72.1%的綜合信息。隨機選取70.0%為訓練集，剩余30%為檢測集建立PCA-決策樹模型，結果顯示PCA-決策樹模型對乙肝纖維化的診斷和預測的準確度分別為92.1%、93.4%，表明PCA-決策樹模型有助于乙肝纖維化的診斷。

綜上所述，在乙肝纖維化的輔助診斷中，PCA-決策樹模型結合RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a診斷乙肝纖維化效果理想。盡管如此，由于診斷誤差和患者本身差異，乙肝纖維化的準確診斷仍較難。由于樣本量有限，本研究尚未全面考察不同組合無創診斷模型對乙肝纖維化診斷和分期的價值，有待后續增大樣本量深入研究。