利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術及環介導等溫擴增技術在結核性腦膜炎的診斷價值

冉燕 趙建軍 張建勇 宗兆婧

遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科結核病區（貴州遵義563003）

我國是全球30 個結核病高負擔國家之一，耐藥結核病患者有增多趨勢［1］，結核性腦膜炎作為最為嚴重的肺外結核病，嚴重者可致殘或導致患者死亡［2-4］，目前臨床上結核性腦膜炎診斷依賴于臨床癥狀、腦脊液化驗和頭顱影像學檢查，由于結核菌涂片陽性率低，且陽性可能為非結核分枝桿菌感染，結核菌培養周期長，頭顱影像學早期改變無特異性，有時會造成漏診、誤診等［5］，對結核性腦膜炎的診斷，尤其是早期診斷目前尚缺乏高效、簡便的方法［6］。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert MTB/RIF）和環介導等溫擴增技術（LAMP）為WHO 認證的可用于結核病診斷的新方法［7］，GeneXpert MTB/RIF 不但能檢測出有無結核分枝桿菌，其還可判斷有無利福平耐藥基因突變，2 h 可獲得結果，LAMP 是在等溫條件下進行DNA 擴增，能快速檢出結核菌，具有操作簡單、耗時更短（50 min）、價廉等優勢，兩種方法均有學者進行研究［8-10］，但目前在結核性腦膜炎的診斷中未見腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP 兩種實驗室方法比較的相關報道，現回顧性分析我科110例結核性腦膜炎患者，探討腦脊液GeneXpert MTB/RIF 及腦脊液LAMP 檢測兩種方法對結核性腦膜炎的早期診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象2016年12月至2019年12月在我院呼吸與危重癥醫學科結核病區和神經內科住院患者，納入110 例臨床診斷為結核性腦膜炎的患者為結核性腦膜炎組，年齡均≥14 周歲且符合《結核性腦膜炎臨床診斷專家共識》［11］及《2019 中國中樞神經系統結核病診療指南》［12］診斷標準，除外妊娠、糖尿病、HIV 感染及免疫缺陷患者，所有患者無抗結核化療病史，院外未降顱內壓治療。結核性腦膜炎合并血行播散性肺結核患者43 例，合并繼發性肺結核58 例，單純結核性腦膜炎患者9 例。110 結核性腦膜炎患者隨機分為A 組和B 組，其中A 組男43 例，平均年齡（55.41±16.07）歲；女17 例，平均年齡（33.19 ± 15.18）歲，B 組男31 例，平均年齡（40.34 ± 18.14）歲；女19 例，平均年齡（40.94 ±20.74）歲，CG 組20 例（診斷為病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎）為對照組，診斷標準參考第8 版《神經病學》［13］。三組患者入院后行頭顱MRI，簽署知情同意書后A 組行腰椎穿刺術抽腦脊液共22 mL 分別查腦脊液常規、生化、結核菌涂片、結核菌培養、GeneXpert MTB/RIF，B 組同樣抽腦脊液22 mL 送腦脊液常規、生化、結核菌涂片、結核菌培養、LAMP，CG 組同樣抽腦脊液24 mL送腦脊液常規、生化、結核菌涂片、結核菌培養、GeneXpert MTB/RIF 和LAMP。腦脊液常規、生化和結核菌涂片均在我院檢驗科完成，腦脊液結核菌培養、GeneXpert MTB/RIF 及腦脊液LAMP 在我科呼吸醫學研究室完成。

1.2 方法

1.2.1 涂片抗酸染色法檢測腦脊液中的抗酸桿菌取腦脊液標本1 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉渣均勻涂抹于玻片2/3 處，將玻片置于染色架上，用火焰固定，滴加石碳酸復紅染液，蓋滿玻片，加熱至出現蒸汽后脫離火焰，保持5 min，輕緩沖洗，瀝水，滴加脫色液，保持1 min，再滴加亞甲藍溶液染色30 s，最后水洗干燥后進行鏡檢，用顯微鏡讀片觀察300 個視野后報告結果。

1.2.2 羅氏培養法檢出腦脊液中的結核分枝桿菌取腦脊液5 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉渣2 ～3 滴接種于2 支培養基斜面上，置37 ℃溫箱培養，分別在第3 天和第7 天各觀察1 次，此后需每周觀察1 次，有菌落生長需經抗酸染色確認后報告，至第8 周無菌落生長則報告為陰性。當結果為陽性時，再采用對硝基苯甲酸鑒定菌落為非結核分枝桿菌或結核分枝桿菌。

1.2.3 腦脊液GeneXpert MTB/RIF 檢測方法取腦脊液8 mL，抗凝后離心10 min，棄上清，取沉淀置于前處理管中，加入GeneXpert MTB/RIF 處理液，劇烈搖動10 ～20 次，室溫放置15 min，一次移液管取2 mL 處理后樣品由加樣孔緩慢加入Cartidge 反應盒內，打開電腦和GeneXpert MTB/RIF 檢測儀，運行GeneXpert MTB/RIF 操作軟件，儀器自檢結束后開始測試，待測試結束后讀取結果。

1.2.4 腦脊液LAMP 檢測方法取腦脊液8 mL，離心后取60 μL 至加熱管，90 ℃加熱5 min，取出吸附管置于吸附架上，勾住吸附管帽環向上提起打開吸附管，將加熱管底部旋入吸附管頂端，震動充分混勻，將吸附管的注射帽放在蓋子里，倒置吸附管，加反應液至兩刻度線之間，將帽環套住純化裝置尖端，丟棄裝置，取毛細管插緊上端后插入陽性對照，吸取液體至刻度線，將其擠入到LAMP 反應管內，握緊底端將全部反應液體甩到蓋子上，倒置2 min，使干燥的LAMP 試劑與反應液充分混合，上下翻轉使充分混勻，當反應模塊溫度達到67 ℃開始LAMP 反應，反應結束后，取出反應管并放入熒光檢測模塊，記錄反應結果。

1.3 統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，所有數據以均數±標準差表示，統計學方法采用χ2檢驗和t檢驗，以P< 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結果比較結核性腦膜炎A 組和結核性腦膜炎B 組患者腰椎穿刺術測腦脊液壓力，送腦脊液常規及生化檢查，提示僅腦脊液蛋白兩組之間存在統計學差異，而腦脊液壓力、白細胞計數、氯化物、葡萄糖、ADA、LDH 兩組之間差異均無統計學意義。見表1。

表1 結核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結果比較Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

表1 結核性腦膜炎A 組患者和B 組患者腦脊液細胞學檢測結果比較Tab.1 Comparison of CSF cytological test results between group A and group B in patients with tuberculous meningitis±s

組別A 組B 組t 值P 值壓力235.39±95.32 218.48±85.99 0.860 0.394腦脊液蛋白3 205.48±2 125.13 3 187.70±2 217.71 2.356 0.532白細胞計數591.67±1 472.71 453.00±1 298.64 1.822 0.068氯化物112.18±10.48 116.09±9.89 1.784 0.080葡萄糖1.65±1.63 2.15±1.12 1.582 0.121 ADA 7.97±4.88 6.02±4.92 1.891 0.064 LDH 106.16±76.99 87.75±78.47 1.122 0.267

2.2 結核性腦膜炎組和CG組腦脊液檢測結果結核性腦膜炎A 組60 例患者結核菌涂片陽性5 例，陽性率8.3%，結核菌培養10 例，陽性率16.7%，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 陽性32 例，陽性率53.0%，利福平耐藥基因檢測陽性3 例。結核性腦膜炎B組50 例患者結核菌涂片陽性4 例，陽性率8.0%，結核菌培養9 例，陽性率18.0%，腦脊液LAMP 陽性29 例，陽性率58.0%。CG 組結核菌涂片、結核菌培養和腦脊液GeneXpert MTB/RIF、LAMP 檢測結果均為陰性。

2.3 結核性腦膜炎A 組、B 組和CG 組組間結果比較結核性腦膜炎A 組和CG 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF對比差異有統計學意義（χ2=17.78，P=0.00）；結核性腦膜炎B 組和CG 組腦脊液LAMP 間差異有統計學意義（χ2=19.81，P=0.00）；結核性腦膜炎A 組和結核性腦膜炎B 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 陽性率對比差異無統計學意義（χ2=0.24，P=0.62）。

2.4 腦脊液蛋白1 000 mg/L以上和1 000 mg/L以下患者腦脊液GeneXpert MTB/RIF和LAMP結果腦脊液蛋白1 000 mg/L 以上患者結核性腦膜炎A 組和B 組分別為40 例和28 例，A 組腦脊液Gen?eXpert MTB/RIF 陽性20 例，陽性率50.0%，B 組腦脊液LAMP 陽性15 例，陽性率53.6%。腦脊液蛋白1 000 mg/L 以下結核性腦膜炎A 組和B 組分別為20 例和22 例，A 組腦脊液GeneXpert MTB/RIF 陽性12 例，陽性率60.0%，B 組腦脊液LAMP 陽性14 例，陽性率63.6%。

3 討論

結核性腦膜炎是結核分枝桿菌感染引起的中樞神經系統非化膿性炎性疾病，其發病率、致殘率和病死率高［14-15］，其預后與早期診斷、早期治療密切相關［14］，但早期診斷有一定的難度，目前實驗室方法有局限性，無法滿足對結核性腦膜炎早期、快速診斷的要求，近年來分子生物學技術開始被關注［16-18］，本研究探討兩種分子生物學技術（腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和LAMP）在結核性腦膜炎中的早期診斷價值。

本研究納入110 例結核性腦膜炎患者，隨機分為結核性腦膜炎A 組和結核性腦膜炎B 組，兩組腦脊液細胞學檢測結果差異無統計學意義，A 組進行腦脊液結核菌涂片、結核菌培養和腦脊液GeneXpert MTB/RIF 檢查，結果表明腦脊液GeneX?pert MTB/RIF 陽性率遠高于結核菌涂片、結核菌培養，腦脊液GeneXpert MTB/RIF結果提示其中有3例患者腦脊液利福平耐藥基因檢測為陽性，該3 例患者結核菌培養結果有2例為陽性，利福平耐藥，表明腦脊液GeneXpert MTB/RIF 不僅能早期判斷有無結核分枝桿菌感染，同時還能判斷有無利福平耐藥，指導臨床用藥。另1例結核菌培養為陰性，其原因分析可能是：（1）傳統藥敏結果受接種技術、培養基質量、孵化時間、藥物耐藥臨界濃度等多種因素影響；（2）不排除該例患者是菌群中同時存在敏感菌和耐藥菌的結合；（3）送檢的結核菌培養和腦脊液GeneXpert MTB/RIF 為非同一份標本，結果可能存在不一致。而腦脊液LAMP 相對于GeneXpert MTB/RIF 檢測需要的時間更短，技術要求不高，價格相對低廉，故將結核性腦膜炎B 組進行結核菌涂片、結核菌培養，腦脊液LAMP 檢查，同樣腦脊液LAMP 陽性率也遠高于結核菌涂片、結核菌培養。本課題腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP對結核性腦膜炎的診斷陽性率均能達到53%和58%，可能和送檢量大（8 mL）有關，有文獻報道高容量的腦脊液能有效提高診斷陽性率［19-20］。同時還選取20 例臨床診斷為化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎的患者進行腦脊液GeneX?pert MTB/RIF 及LAMP 檢測，結果20 例患者腦脊液結核菌涂片、結核菌培養、GeneXpert MTB/RIF 及LAMP 全為陰性。以上結果揭示腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 均是早期診斷結核性腦膜炎較好的實驗室方法，特異性好，敏感性高，兩種檢測耗時均短（分別耗時2 h 及50 min），優于目前常規檢測手段，可以作為早期診斷結核性腦膜炎的可靠指標。

結核性腦膜炎患者在腦膜發生炎癥的情況下，血腦屏障受損，通透性增高，進入腦脊液的蛋白量升高［21］，故腦脊液蛋白對結核性腦膜炎的診斷有較大的參考價值，腦脊液蛋白越高提示腦膜損壞越嚴重，結核菌繁殖越旺盛，有文獻報道腦脊液蛋白含量升高的程度為影響結核性腦膜炎早期診斷的獨立因素［22］。大多數結核性腦膜炎患者腦脊液蛋白在1 000 mg/L 以上，本研究分析未抗結核化療前腦脊液蛋白在1 000 mg/L 以上和1 000 mg/L以下患者的腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 的陽性率，實驗結果提示即使在腦脊液蛋白1 000 mg/L 以下，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 的陽性率仍可達到60.0%和63.6%，遠高于腦脊液結核菌涂片和結核菌培養，提示在腦脊液表現不典型的情況下腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 對臨床結核性腦膜炎的早期確診提供了實驗室診斷依據。

綜上所述，腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 兩種技術對結核性腦膜炎的診斷陽性率高，且耗時短，能早期獲得結果，對結核性腦膜炎的診斷有重要價值，但兩者各有優勢，故建議在經濟比較發達地區，可選擇腦脊液GeneXpert MTB/RIF 或LAMP 檢測有效提高診斷陽性率，但在基層醫院或經濟貧困地方可先行腦脊液LAMP，若臨床高度懷疑耐藥的患者仍可選擇腦脊液GeneXpert MTB/RIF。本研究標本數量偏少，接下來擬擴大標本量進一步對同一份標本進行腦脊液GeneXpert MTB/RIF 和腦脊液LAMP 檢查，希望能更進一步提高結核性腦膜炎早期診斷率，早期指導治療和改善患者預后。