抑制miR-93-5p表達對人卵巢癌細胞增殖和遷移的影響

趙靈琴 于愛軍 劉文洪 高雯 方晨燕 張平

卵巢癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌及子宮內膜癌，位居第3，而其病死率則高居婦科腫瘤之首[1]，約有45%～60%的病理確診的患者最終將死于卵巢癌[2-3]。目前卵巢癌的治療主要以手術切除為主，術后化療為輔，從而提高患者的臨床緩解率及延長中位生存時間，但由于化療耐藥的存在影響治療療效，腫瘤復發(fā)和轉移也是影響患者預后的關鍵因素[4-5]。盡管卵巢癌治療在現代技術的發(fā)展中已經取得了諸多成就，但卵巢癌背后的分子機制仍是癌癥研究領域的焦點。

miRNA生物學效應廣泛，對個體發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡等生理活動均起重要調控作用[6]。研究表明，超過50%的編碼基因位于與腫瘤相關的基因位點，這說明miRNA可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[7]。基因變異導致相關功能因子表達紊亂在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用相關研究是目前腫瘤研究熱點[8]。有研究指出在肝癌[9]及胃癌[10]中miR-93作為癌基因直接靶向程序性細胞死亡因子4從而促進癌癥的形成。然而，miR-93-5p在卵巢癌當中的作用及機制卻少有報道。本研究旨在探討miR-93-5p對卵巢癌細胞增殖和轉移的影響，并初步探究可能的下游調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 正常卵巢上皮細胞（IOSE80）與卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑 DMEM/F-12（1∶1）、FBS均購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；四甲基亞唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自上海碧云天公司；Trizol、反轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit均購自日本Takara公司；miR-93-5p抑制物（miR-93-5p inhibitor）、空載體陰性對照物、miR-93-5p模擬物（miR-93-5p imimics）、對照物（miR-NC）、轉染試劑 Lipofectamine 2000 Transfection均購自山東維真生物科技有限公司；一抗（RBM24、GAPDH）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗均購自美國CST公司；ECL顯影液購自美國Bio-Rad公司。

1.3 儀器 3110型二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；Ti-U型熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；ME155DU型電子天平購自瑞士梅特勒公司；GT10-2型臺式離心機購自北京金洋萬達科技有限公司；J-HH-6A型恒溫水浴箱購自上海梓桂儀器有限公司；MDFU3386S型超低溫冰箱購自日本Sanyo公司；TS-1型轉移脫色搖床購自上海亞榮生化儀器廠；1658001型電泳儀購自美國Bio-Rad公司；JS-1070Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司；Synergy2型多功能酶標儀購自美國BioTek公司；7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.4 細胞培養(yǎng) 正常卵巢上皮細胞（IOSE80）與卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）培養(yǎng)于含 10% FBS、青霉素200 U/ml、鏈霉素200 U/ml的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，待細胞達到80%～90%融合度后，經胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)，取對數期細胞用于實驗。

1.5 miR-93-5p相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。使用 Trizol試劑從 IOSE80、SKOV3、A2780、ES2 細胞株中提取總RNA。按照反轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和 SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Ki試劑盒進行逆轉錄和qRT-PCR。miR-93-5p上游引物序列：5′-AGCAGTAGGTTGGGTAATC-3′，下游引物序列：5′-GCTGTTCGTGCAGGTAGT-3′。miR-93-5p 以 U6 為內參，U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；（95 ℃，30 s；60 ℃，1 min）×40；60 ℃，5 min。

1.6 基因轉染 將miR-93-5p inhibitor和空載體陰性對照物干粉用RNase-free水配制成20 μmol/L的母液后分裝、凍存?zhèn)溆谩KOV3細胞分成inhibitor組和陰性對照組（NC組），兩組細胞消化后鋪在6 cm的培養(yǎng)皿中，過夜至細胞密度達70%左右。棄去培養(yǎng)基后加入無血清MEM培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000 Transfection試劑盒說明書要求進行轉染，其中inhibitor組轉染miR-93-5p inhibitor，NC組轉染陰性對照物。孵育6～8 h后，棄去原培養(yǎng)基，換成完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.7 細胞相對存活率檢測 采用MTT法。收集對數期inhibitor組和NC組細胞，調整細胞密度為3 000個/孔，每個實驗組設置4個復孔，每孔100 μl加入到96孔板，置37℃含有5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞經轉染后，繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48、72 h，每孔加入 20 μl濃度為 5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO后震蕩10 min，用酶標儀在570 nm處測定吸光度（OD值）。重復實驗3次，以平均值統(tǒng)計結果，計算各濃度下細胞相對存活率。相對存活率（%）=（各實驗組OD/0 h OD）×100%

1.8 細胞相對遷移率檢測 采用細胞劃痕實驗。取對數期inhibitor組和NC組細胞，接種于6孔板中培養(yǎng)，調整細胞密度為6×105個/孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h且單層細胞鋪滿6孔板板底時（細胞融合度約為90%），將滅菌尺固定于孔的正上方中央位置，用裝有200 μl槍頭的移液槍沿著滅菌尺滑動，劃痕橫穿過孔。每孔劃3條長直劃痕，作為每組細胞平行組。小心吸掉培養(yǎng)基，用PBS小心地清洗3遍，洗去劃痕產生的漂浮細胞。然后換上新的培養(yǎng)基。分別于劃痕后0、12、24 h后，用顯微鏡拍照并記錄劃痕愈合程度。然后用Image J軟件分析，并計算細胞相對遷移率。

1.9 RBM24蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法。裂解并提取inhibitor組和NC組細胞的蛋白，根據碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行標準曲線的制備，根據標準曲線計算出各個樣品的蛋白含量，調整樣品濃度后進行上樣，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉印，5%脫脂奶粉封閉，封閉后加入相應一抗4℃搖床過夜，第2天加入相應二抗，室溫孵育2 h后TBST洗膜3次。ECL浸泡后用化學發(fā)光熒光成像系統(tǒng)對圖像進行掃描和分析。

1.10 熒光素酶報告基因檢測 收集對數期的SKOV3細胞，將細胞分為對照組（miR-NC組）和過表達組（miR-93-5p mimics組），胰酶消化離心，重懸后調整細胞懸液濃度為1×106個/ml，并接種至6孔板，在細胞融合度約50%時使用LipofectamineTM2000轉染試劑，將miR-NC轉染至miR-NC組，將miR-93-5p mimics轉染至miR-93-5p mimics組，另外將pGL3空白質粒、RBM24 3′-UTR 突變型質粒、RBM24 3′-UTR 野生型質粒共轉染至兩組細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h。加入細胞裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進行熒光素酶活性檢測。通過比較熒光強度判斷miR-93-5p對RBM24的調控作用。

1.11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞中miR-93-5p相對表達量比較 miR-93-5p 在卵巢癌細胞（SKOV3、A2780、ES2）中的表達水平均明顯高于正常卵巢上皮細胞（IOSE80），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。根據此結果，本研究團隊選取miR-93-5p表達量最高的SKOV3細胞株進行后續(xù)實驗。

表1 不同細胞中miR-93-5p相對表達量比較

2.2 兩組細胞相對存活率比較 與NC組相比，inhibitor組細胞在48和72 h時的相對存活率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組細胞相對存活率比較（與NC組比較，*P＜0.05）

2.3 兩組細胞相對遷移率比較 Inhibitor組細胞在12 h時的相對遷移率為（40.67±4.21）%，在24 h時的相對遷移率為（33.76±3.42）%，與NC組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。見圖2和表2。

2.4 兩組細胞RBM24蛋白相對表達量比較 與NC組比較，inhibitor組細胞中RBM24蛋白相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3和表3。

2.5 miR-93-5p靶基因預測及驗證 通過TargetScan靶點預測軟件預測到RBM24是miR-93-5p潛在的靶基因，見圖4。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-93-5p mimics組中RBM24-MUT表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而RBM24-WT表達則顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

卵巢癌是臨床上常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病之一，其發(fā)病率位于三大婦科惡性腫瘤之末，但病死率卻高居首位，由于卵巢組織具有解剖部位隱蔽性及內分泌功能復雜性，導致卵巢癌早期癥狀不明顯，不易被發(fā)現，嚴重威脅女性的生命健康[11]。因此，尋找有效的卵巢癌分子標志物是當下的研究熱點。

圖3 兩組細胞RBM24蛋白表達的電泳圖

表3 兩組細胞RBM24蛋白相對表達量比較

圖4 TargetScan靶點預測結果

表4 熒光素酶報告基因檢測結果

miRNA是近年來發(fā)現的一類長度較短的單鏈非編碼RNA，與靶基因的3′非翻譯區(qū)互補結合，能夠通過誘導靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，從而實現對靶基因的調控作用[12]。近幾年研究發(fā)現miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，許多miRNA在腫瘤中呈現異常表達。miRNA根據其在癌癥發(fā)生中的作用分為兩類：一類為致癌miRNA，另一類為抑癌miRNA。致癌miRNA通過抑制抑癌基因的靶mRNA，發(fā)揮其致癌作用，例如miR-448能夠通過下調SPACRL1的表達進而促進口腔鱗癌增殖及遷移的能力[13]；miR-182通過抑制FOXO1的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移[14]。而抑癌miRNA通過抑制癌基因的靶mRNA的表達，發(fā)揮抑癌作用，例如miR-363能夠通過靶向作用于CTHRC1，進而抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移[15]；miR-126通過下調NCoA7的表達，進而抑制ARNT介導的肺鱗癌細胞增殖[16]。miR-93-5p位于染色體11q22.1，屬于miR-106b-25家族。研究發(fā)現miR-93-5p在胃癌中表達上調，并能夠通過靶向調控Hippo信號通路從而促進胃癌細胞的增殖和轉移[17]。有研究發(fā)現miR-93在結腸癌病灶中表達顯著下調，其表達降低與結腸癌轉移、分化和預后不良密切相關，并且上調miR-93的表達能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制結腸的侵襲和轉移[18]。同時，也有研究顯示miR-93-5p與結直腸癌[19]、食管癌[20]和肺癌[21]的發(fā)生、發(fā)展密切相關。雖然目前關于miR-93-5p的報道已有很多，但主要集中在胃癌、結直腸癌的研究中。

本研究結果顯示，相對于正常卵巢上皮細胞，miR-93-5p在卵巢癌細胞中顯著高表達，表明miR-93-5p可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程。因此，本研究通過轉染miR-93-5p inhibitor，實現抑制卵巢癌細胞SKOV3中miR-93-5p的相對表達量。MTT結果顯示，轉染miR-93-5p inhibitor的細胞相對存活率受到抑制，同時細胞劃痕實驗結果顯示，轉染miR-93-5p inhibitor的細胞相對遷移率也受到抑制，較NC組均有統(tǒng)計學差異。這表明在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，miR-93-5p可能起到促進癌細胞生長和轉移的作用。

卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展受到多種基因和蛋白的調控，而研究關于這些相關基因和蛋白對了解卵巢癌的發(fā)病機制具有重要意義。RBM24在肌原性的分化和心臟發(fā)育中起著重要的作用。有研究表明，RBM24可以在轉錄水平上調節(jié)p21和p63的穩(wěn)定性[22]。目前已有文獻指出RBM24在乳腺癌中呈現低表達[23]，并且在鼻咽癌中起到抑癌的作用[24]。在本研究中，生物信息學軟件分析表明RBM24是miR-93-5p直接作用的靶基因，熒光素酶報告基因實驗驗證了該結果，并且在卵巢癌細胞SKOV3中抑制miR-93-5p后，RBM24蛋白的表達量顯著升高，進一步說明miR-93-5p能夠抑制卵巢癌細胞中的RBM24的表達量。以上結果均提示，miR-93-5p在卵巢癌細胞中高表達，可以通過負調控靶基因RBM24促進卵巢癌細胞的增殖和轉移。因此，miR-93-5p可能是卵巢癌腫瘤發(fā)展過程中的重要因子，可能成為卵巢癌診斷或治療的新靶點。