HDAC抑制劑Quisinostat對肝癌Huh7細胞增殖和凋亡的影響及作用機制

胡霄 朱明輝 蒲青凡 周瑞耀

原發性肝癌（90%以上是肝細胞性肝癌）是全球范圍內的常見惡性腫瘤，具有高病死率和高發病率的特點，而中國的肝癌發病數占全球肝癌總發病數的50%[1]。目前，手術切除是肝癌最主要的治療方式，放化療對肝癌的治療效果比較有限。顯然，研究和開發新型的抗肝癌藥物以提高中晚期肝癌患者的治療效果和延長其生存期具有重要的臨床意義。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）具有催化組蛋白去乙酰化，維持染色體中組蛋白乙酰化/去乙酰化平衡的功能。組蛋白乙酰化與基因轉錄、細胞周期進展、基因沉默、DNA復制、DNA損傷修復和細胞分化等現象有關[2]。Quisinostat是新型氧肟酸鹽類HDAC抑制劑，其主要抑制靶點為I類和Ⅱ類HDAC家族蛋白[3]。體外研究證實Quisinostat在肺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多個腫瘤細胞株中有明顯的抑癌效果[3]，但對其具體抗腫瘤機制尚未完全闡明。目前國內鮮見報道Quisinostat對肝癌抑制作用的研究。因此，本研究通過觀察HDAC抑制劑Quisinostat對肝癌細胞株Huh7細胞增殖和凋亡的影響，以評價Quisinostat的抗肝癌效果，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 肝癌細胞株 Huh7購自中國科學院上海細胞生物學研究所。由本實驗室培養凍存。

1.1.2 藥品HDAC抑制劑Quisinostat（規格：5 mg/支）購自美國Selleck公司；Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（規格：1 mg/支）購自美國Selleck公司。上述藥物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解、分裝，-20℃避光保存。實驗前用MEM培養液稀釋成工作濃度。控制DMSO終濃度≤0.1%。

1.1.3 實驗試劑RIPA細胞裂解液、BeyoECL Plus（P0018）試劑盒、細胞周期試劑盒均購自南京碧云天生物技術公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；凋亡試劑盒（Annexin-V FITC/PI）購自日本同仁化學研究所；B淋巴細胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）、剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）等兔單克隆抗體均購自美國CST公司；β-肌動蛋白（β-Actin）、p53蛋白、細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、p21 和 p27 等兔單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔第二抗體均購自美國Abcam公司。

1.1.4 主要儀器 IX71倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；高速冷凍離心機（micro21R型）購自美國Thermo Fisher公司；蛋白凝膠電泳系統購自美國Bio-rad公司（ChemiDoc MP化學發光成像系統）；DYNEX MUM型酶標儀購自美國DYNEX Technologies公司；BD LSRII數字化分析型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度Quisinostat處理組細胞增殖抑制率檢測 采用CCK-8法。取處對數生長期的Huh7細胞，接種細胞密度為3×104/ml。將細胞種于96孔板，細胞數為3 000個/孔。細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度的Quisinostat，使其終濃度分別 12.5、25、50、100、200 nM，對照組則加等量不含Quisinostat的培養液。每種濃度5個平行孔。分別于24、48、72 h取1塊96孔培養板測定吸光度（OD值）以計算細胞增殖抑制率。計算公式：細胞增殖抑制率＝1－OD（藥物）/OD（對照）。

1.2.2 不同濃度Quisinostat處理組細胞周期占比檢測采用流式細胞術。取處對數生長期的Huh7細胞，接種于6孔板中，Huh7細胞種板數為15×104個。細胞貼壁后加入0、25、50 nM Quisinostat處理48 h。實驗重復3次，取平均值。48 h后消化收集0、25、50 nM處理的肝癌細胞，制成細胞懸液。應用含有0.2 mg RNase A的1 ml PI/Triton X-100 染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）37℃染色15 min。流式細胞儀測定細胞周期，用Modfit LT軟件分析流式周期結果，統計不同濃度組G0/G1期、S期、G2/M期、S期+G2/M期所占百分比。

1.2.3 不同濃度Quisinostat處理組細胞凋亡率檢測采用Annexin-V FITC/PI雙染法。取處對數生長期的Huh7細胞接種于6孔板中。Huh7細胞種板數為15×104個。細胞貼壁后加入 0、25、50、100 nM Quisinostat處理48 h。實驗重復3次，取平均值。培養48 h后收集細胞，采用Annexin-V FITC/PI凋亡試劑盒對細胞進行染色，用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.4 單用Quisinostat和聯合Z-VAD-FMK處理Huh7細胞的凋亡率檢測 采用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測。取處對數生長期的Huh7細胞接種于6孔板。細胞貼壁后加藥。實驗分組：0 nM Quisinostat組、50 nM Quisinostat組、50 nM Quisinostat＋50 μm Z-VAD-FMK組（作為實驗組）。藥物處理48 h后，收集細胞，用Annexin-V FITC/PI凋亡試劑盒對細胞染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 不同濃度Quisinostat處理組細胞凋亡和周期相關蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。取對數生長期細胞接種于6 cm平皿，待細胞貼壁后加入0、25、50、100 nM Quisinostat。48 h 后提取總蛋白，用 BCA法測定蛋白濃度。等量加樣，蛋白質電泳轉膜后，封閉液室溫封閉2 h。用1∶1 000稀釋的目的蛋白一抗于4℃孵育過夜。洗膜后用1∶2 000稀釋的二抗孵育2 h。用BeyoECL Plus（P0018）試劑使目的蛋白發光。用Bio-rad ChemiDoc MP化學發光成像系統拍照，分析測定各條帶面積灰度值。實驗重復3次，取平均值。以β-Actin為內參，用上述方法分析目的蛋白（BAX、Bcl-2、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、p53、Cyclin D1、p21 和p27蛋白）的表達水平。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.01統計軟件。計量資料用表示。多組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細胞增殖抑制率比較 隨著Quisinostat濃度增加，Huh7細胞增殖抑制率逐漸增加（P＜0.05）；同一濃度Quisinostat下Huh7細胞增殖抑制率隨著時間延長也逐漸增強（P＜0.05）。見圖1。

2.2 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細胞各細胞周期占比的比較 與0 nM組相比，25、50 nM組G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，S期+G2/M期細胞明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而3組比較G2/M期差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細胞增殖抑制率比較

2.3 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細胞凋亡率比較 3組間Huh7細胞晚期、早期凋亡率比較差異均有統計學意義（均 P＜0.05），且與 0 nM 比較，25、50、100 nM組Huh7細胞晚期、早期凋亡率均更高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細胞各細胞周期占比的比較

2.4 單用Quisinostat與聯合Z-VAD-FMK處理Huh7細胞的凋亡率比較 3組間Huh7細胞晚期、早期凋亡率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且與0 nM Q組比較，50 nM Q 組、50 nM Q+50 μm Z 組 Huh7細胞晚期、早期凋亡率均更高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與 50 nM Q 組比較，50 nM Q+50 μm Z 組 Huh7細胞晚期、早期凋亡率均更低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表 3。

表2 不同濃度Quisinostat作用下肝癌Huh7細胞凋亡率比較

2.5 不同濃度Quisinostat組Huh7細胞凋亡、細胞周期相關蛋白表達水平比較 Western blot結果顯示，隨著Quisinostat濃度升高，BAX、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p53、p21、p27 蛋白表達水平均逐漸增高，Bcl-2、Cyclin D1蛋白表達水平均逐漸降低，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。見圖 2、3，表 4、5。

表3 單用Quisinostat與聯合Z-VAD-FMK處理Huh7細胞的凋亡率比較

圖2 不同濃度Quisinostat組Huh7細胞凋亡相關蛋白表達的電泳圖（Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2蛋白；BAX為Bcl-2相關X蛋白；Cleaved Caspase-3為剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-3；Cleaved Caspase-9為剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-9）

3 討論

圖3 不同濃度Quisinostat組Huh7細胞周期相關蛋白表達的電泳圖（Cyclin D1為細胞周期蛋白D1）

Quisinostat是一種新型的HDAC抑制劑。一項基于嚙齒類動物模型的研究證實Quisinostat能有效的抑制多發骨髓瘤，明顯減輕實驗動物的腫瘤負荷，并減少腫瘤血管新生[4]。有臨床Ⅰ期研究用Quisinostat+硼替佐米+地塞米松的聯合方案治療復發的多發性骨髓瘤患者，其中約88.2%的患者可取得較好的治療效果[5]。此外，有臨床Ⅰ期研究用Quisinostat治療實體瘤患者，該研究總共納入了92例患者，其中9.8%的患者病情經治療后能得到有效控制[6]。另有臨床Ⅱ期研究評價了Quisinostat治療復發或難治性皮膚T細胞淋巴瘤的療效，結果顯示總皮膚反應率為24%，其中1例患者經Quisinostat治療150 d，皮膚腫瘤完全緩解，5例患者的皮膚腫瘤部分緩解[7]。本研究表明Quisinostat能有效將肝癌Huh7細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖，并且誘導肝癌細胞發生凋亡，從而導致肝癌細胞的生長抑制。

細胞周期轉化由周期蛋白依賴激酶（CDK）和其對應的活化亞單位周期蛋白所控制。Cyclin D1是G1/S期更換的重要周期蛋白。Cyclin D1表達下降，則細胞阻滯于G1期[8]。p21和p27則是與G1/S期轉換相關的上游調控蛋白，起抑制周期蛋白/CDK復合物功能的作用[9]。在本實驗中，不同濃度的Quisinostat作用后，Huh7細胞的周期蛋白Cyclin D1表達下降，而p21和p27蛋白表達明顯上調。因此，筆者認為Quisinostat可通過誘導p21和p27蛋白的表達，抑制Cyclin D1蛋白，達到周期阻滯。

為明確Quisinostat誘導凋亡機制，筆者檢測了凋亡效應蛋白的改變。在不同濃度的Quisinostat的作用下，隨著凋亡程度的提高，活化形式的Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達水平也明顯增加，這些數據從分子水平證實Quisinostat激活了Cleaved Caspase-9為代表的線粒體途徑。Caspase抑制劑Z-VAD-FMK抑制了Quisinostat的促凋亡作用，進一步證實了Quisinostat促凋亡作用對Caspase途徑的依賴性。線粒體異常是激活Caspase效應蛋白的上游機制之一。Bcl-2家族蛋白的失衡、Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道是導致線粒體膜通透性改變及線粒體途徑凋亡的重要原因[10]。本研究結果證實在Quisinostat處理肝癌細胞后，Bcl-2/BAX比率明顯下降。p53蛋白是線粒體途徑凋亡上游重要調控因子，筆者發現Quisinostat處理肝癌細胞后，p53蛋白表達明顯增加。p53過度表達能抑制Bcl-2，且活化BAX，導致凋亡。因此，筆者認為p53信號通路激活，線粒體凋亡相關蛋白失衡，是Quisinostat誘導肝癌細胞凋亡的重要機制。

表4 不同濃度Quisinostat組Huh7細胞凋亡相關蛋白表達水平比較

表5 不同濃度Quisinostat組Huh7細胞周期相關蛋白表達水平比較

綜上所述，Quisinostat在體外能有效抑制肝癌細胞生長，它有潛力成為治療肝癌的藥物。但目前還有較多未知問題需要進一步研究。首先，Quisinostat對其他信號分子的作用需深入明確；其次，Quisinostat對肝癌細胞侵襲、遷移和血管新生的作用需進一步闡明。相信對Quisinostat的深入研究，將為肝癌治療提供新的藥物選擇。