直腸癌患者術(shù)后血清miR-204、miR-182水平與應(yīng)激性潰瘍出血發(fā)生的相關(guān)性

徐敏，王義增 ，潘立峰，康偉明

1 天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院、天津市內(nèi)分泌研究所、國家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；3 石家莊市婦幼保健院

直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來，直腸癌的發(fā)病率呈逐年增長的趨勢(shì)，并且更趨向年輕化［1］。臨床上多采取手術(shù)治療，早期直腸癌患者術(shù)后5 年生存率可達(dá)90%以上，晚期術(shù)后生存率可能不足10%［2］，而目前大多數(shù)直腸癌患者被檢出時(shí)已發(fā)展到中晚期。應(yīng)激性潰瘍出血（SUB）是直腸癌患者術(shù)后較為典型的并發(fā)癥之一，主要臨床表現(xiàn)為急性黏膜糜爛、潰瘍，最后發(fā)展為出血、腸穿孔等，給患者生理、心理造成極大打擊［3］。微小RNA（miR?NA）為一類長18～22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈小非蛋白編碼 RNA［4］，大量研究表明，miRNA 的靶基因調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，通過參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能調(diào)控腫瘤的發(fā)展、遷移［5］。MO?HAMED等［6］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-204、miR-182 均呈高表達(dá)，且對(duì)胃癌有一定的診斷價(jià)值，但關(guān)于miR-204、miR-182 與直腸癌患者的相關(guān)性研究報(bào)道并不多見。因此，本研究通過探究直腸癌患者術(shù)后血清 miR-204、miR-182 水平與 SUB 發(fā)生的相關(guān)性，以期為臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2016 年 6 月—2019 年 11 月天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院收治的直腸癌手術(shù)患者237 例為研究對(duì)象（觀察組），所有患者經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為直腸癌，其中男 129 例、女 108 例，年齡 26～74 歲。根據(jù)術(shù)后是否發(fā)生SUB 分為SUB 組（12 例）和非SUB 組（225例），SUB 的發(fā)生率為5.06%。滿足以下其中一項(xiàng)即可判定為SUB：①嘔吐物或胃抽取物肉眼可見鮮紅色或咖啡色液體；②柏油樣便、黑便或糞隱血試驗(yàn)呈陽性；③經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)患者胃黏膜部位出現(xiàn)片狀或點(diǎn)狀血灶、潰爛或糜爛等［7］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤；②傳染性疾病；③近1 個(gè)月有消化道潰瘍史；④合并血液系統(tǒng)疾病。同期選取20 例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男13 例、女7 例，年齡23～72 歲。對(duì)照組與觀察組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象知曉并自愿簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床相關(guān)資料采集 由2 名專業(yè)醫(yī)師統(tǒng)計(jì)并記錄患者臨床資料信息，包括患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、肝腎功能狀況、術(shù)前合并心腦血管疾病情況、術(shù)后并發(fā)癥等。

1.2.2 血清miR-204、miR-182 檢測 主要試劑與儀器：TRIzol 試劑（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海研卉生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒SYBR Premix Ex Taq（美國UNIBIOTEST 公司）；BY/TD-3A 型血型血清學(xué)多用離心機(jī)（北京海富達(dá)科技有限公司）；CFX384 Touch 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。所有患者入院24 h內(nèi)采集靜脈血4 mL，健康體檢者采集晨起空腹外周血4 mL，4 ℃下2 000 r/min離心15 min，收集上層清液于干凈EP 管中，-20 ℃保存待測。為防止反復(fù)凍融影響血清內(nèi)容物水平，樣品每隔一段時(shí)間統(tǒng)一檢測。使用TRIzol試劑提取總RNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，所有操作按照說明書操作規(guī)范進(jìn)行。以cDNA為模板，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測血清 miR-204、miR-182。 總 反 應(yīng) 體 系 20 μL：SYBR Premix Ex Taq 9μL，上游引物1μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 7 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃，預(yù)變性2 min；95 ℃，變性20 s；62 ℃，退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-204、miR-182均以U6為內(nèi)參，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-204上游引物序列：5"-ACGCGGCTGGGAAGGCAAAG-3"、下游引物序列：5"-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3"，miR-182上游引物序列：5"-GGCTTTGGCAATGGTAGAAC-3"、下游引物序列：5"-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3"，U6上游引物序列：5"-GCTTCGGCAGCACATATATA-3"，下游引物序列：5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTGT-3"。用 2-ΔΔCt法計(jì)算血清 miR-204、miR-182 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析直腸癌術(shù)后發(fā)生SUB 患者血清miR-204 與miR-182 水平的相關(guān)性；利用Logistic 回歸分析影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB 的危險(xiǎn)因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-204、miR-182 水平比較 觀察組血清miR-204、miR-182 水平均低于對(duì)照組（P均<0.05）；SUB 組血清 miR-204、miR-182 水平低于非SUB組（P均<0.05），見表1、2。

2.2 血清miR-204、miR-182水平與直腸癌SUB患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 血清miR-204、miR-182 水平與SUB直腸癌患者年齡、性別、TNM分期無關(guān)，與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P均<0.05）。見表3。

表1 觀察組與對(duì)照組血清miR-204、miR-182水平比較（-x ± s）

表2 SUB組、非SUB血清miR-204、miR-182水平比較（-x± s）

表3 血清miR-204、miR-182水平與直腸癌SUB患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 直腸癌患者術(shù)后血清miR-204、miR-182 水平與SUB發(fā)生的關(guān)系

2.3.1 影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB 的單因素分析 SUB組和非SUB組性別比例、吸煙史比例、飲酒史比例、肝腎功能異常比例、術(shù)中出血量、術(shù)后使用糖皮質(zhì)激素比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組年齡、術(shù)前合并心腦血管疾病比例、術(shù)后發(fā)生其他并發(fā)癥比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB的單因素分析［例（%）］

2.3.2 影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB 的多因素分析 以直腸癌患者術(shù)后是否發(fā)生SUB 作為因變量，將年齡≥60 歲、合并心腦血管疾病、術(shù)后有其他并發(fā)癥及血清miR-204、miR-182 水平作為自變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，年齡≥60 歲、低水平miR-204、低水平miR-182 是影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表5。

2.4 SUB 組血清 miR-204 與 miR-182 水平的相關(guān)性 SUB 組患者血清miR-204 與miR-182 水平呈正相關(guān)（r=0.471，P<0.05）。

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在腫瘤的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNA 參與腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制一般為miRNA 位于基因組不穩(wěn)定區(qū)或癌基因表達(dá)區(qū)，或者miRNA 在機(jī)體正常組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中差異性表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)揮致癌或抑癌基因作用。已有部分miRNA 分子被證實(shí)可作為某些癌癥的藥物治療靶點(diǎn)及腫瘤診斷標(biāo)志物，在對(duì)診斷腫瘤分型、判斷患者預(yù)后等方面起重要的積極意義［8-9］。卞慧萍［10］利用 miRNA 定量 PCR 芯片從結(jié)直腸癌（CRC）患者血清中篩選出7 個(gè)差異性表達(dá)的miRNA，其中miR-204 表達(dá)顯著升高，且對(duì)CRC 有一定的識(shí)別、診斷價(jià)值。而劉揆亮等［11］從結(jié)直腸瘤—腺癌序列中篩選出15 個(gè)差異表達(dá)的miR?NA，其中miR-204 表達(dá)顯著低于正常對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-204 水平較對(duì)照組低，與劉揆亮等［11］結(jié)論一致，與卞慧萍［10］研究結(jié)果不一致，可能與操作者手法、地域差異、儀器設(shè)備等因素有關(guān)。另外，發(fā)生SUB 患者血清miR-204 水平低于未發(fā)生SUB 患者，提示miR-204 水平低可能與SUB 發(fā)生有關(guān)。

表5 影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB的多因素分析

研究發(fā)現(xiàn)，miR-204位于人類染色體7q32上［12］，是脊椎動(dòng)物基因中高度保守序列之一，可表達(dá)于機(jī)體多種組織及細(xì)胞中。近年來，關(guān)于miR-204 與腫瘤關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)。李麗霞等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-204 可能通過靶向SIRT1 表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞的分化、增殖起抑制作用，提示miR-204 可能作為評(píng)估NSCLC 腫瘤分化程度及預(yù)后的新靶點(diǎn)。越來越多的研究表明，miR-204 可能通過抑制腫瘤相關(guān)靶基因表達(dá)或降解蛋白，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起抑制作用［14］，比如肺癌、乳腺癌等［15-16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-204水平與直腸癌SUB 患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，經(jīng)Logistic回歸分析可知，血清低水平miR-204是影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB 的危險(xiǎn)因素，提示血清miR-204 可能與直腸癌患者嚴(yán)重程度有關(guān)，可能通過靶向抑制某種蛋白轉(zhuǎn)錄，激活多種通路發(fā)揮抑癌基因作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

大量研究表明，miR-182 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有差異性，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡起重要的調(diào)控作用。蔣華鋒等［17］認(rèn)為，miR-182 在直腸癌組織中呈高表達(dá)，并通過靶向調(diào)控p53 表達(dá)在腫瘤中發(fā)揮作 用 。 楊 洲 等［18］研 究 提 示 ，miR-182 可 負(fù) 調(diào) 控SATB2 表達(dá)，可能通過促進(jìn)SW480 細(xì)胞神經(jīng)鈣黏素的增加，增強(qiáng)癌細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)及生存能力起促癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-182水平低于對(duì)照組，且術(shù)后發(fā)生直腸癌SUB 患者的miR-182 水平高于未發(fā)生SUB 患者，經(jīng)臨床病理分析可知，miR-182 與直腸癌SUB 患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，另外，血清低水平miR-182 是影響直腸癌患者術(shù)后發(fā)生SUB 的危險(xiǎn)因素，提示miR-182 可能參與直腸癌患者SUB 的發(fā)生發(fā)展過程，與林德等［19］結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后發(fā)生 SUB 直腸癌患者血清 miR-204、miR-182 均低，且二者呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者可能在SUB 的發(fā)展中起協(xié)同作用，但具體作用尚不明了。

綜上所述，直腸癌術(shù)后患者血清miR-204、miR-182 水平低，且發(fā)生SUB 患者均低于未發(fā)生者，血清低水平miR-204、miR-182 可能與直腸癌術(shù)后發(fā)生SUB 有關(guān)。然而，關(guān)于 miR-204、miR-182 之間的相互作用以及在直腸癌中的具體作用機(jī)制有待更深入研究。