胃癌組織中miR-760、BST2的表達變化及意義

蔡永昌，李瑞平

東莞市人民醫院，廣東東莞 523000

胃癌是威脅全球人類健康的常見惡性腫瘤之一，每年胃癌的病死率約為10%［1］。幽門螺桿菌感染、飲食結構的改變是罹患胃癌的危險因素［2］。胃癌早期臨床癥狀不明顯，部分患者發現時已是晚期，多伴有轉移及周圍組織浸潤，經治療后易復發且預后差，5 年生存率低于 30%［3］。因此，有必要探索診斷胃癌的新的有效生物標志物。微小RNA（miR?NA）長度約為22 個核苷酸，是小的單鏈非編碼RNA，與靶mRNA 的3"非翻譯區（UTR）結合，進而調節基因表達［4］。有研究表明，miR-760在多種腫瘤組織中表達呈異常狀態，如肺癌、乳腺癌［5-6］，通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲能力進而調節腫瘤的發生發展。骨髓基質細胞抗原2（BST2）是一種Ⅱ型跨膜蛋白，也稱為Tetherin、CD317。BST2 廣泛表達于骨髓基質細胞、B 細胞、T 細胞及 NK 細胞等［7］。有研究報道，BST2在其他免疫細胞和惡性細胞中也有表達，包括B 細胞慢性淋巴白血病細胞［7］、肺癌細胞［8］。越來越多研究表明，BST2 可調節多種腫瘤的發生發展，如乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌［9］。本研究通過檢測胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 的相對表達量來分析兩者與臨床病理參數之間的關系，探討兩指標在胃癌發生發展過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2018 年 6 月—2019 年 5 月于我院住院治療的胃癌患者82例。納入標準：均經活檢或術后病理檢查明確診斷為胃癌；均為首次診斷胃癌，從未做過放療或化療治療；臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標準：患有其他消化系統疾病，如胃炎、胃潰瘍等；患有其他系統疾病或者惡性腫瘤，如食管癌、乳腺癌等；患有免疫功能缺陷疾病。82 例患者，男 56 例，女 26 例；年齡 41～69（55.31 ± 2.2）歲；≥55 歲 37 例，<55 歲 45 例；根據胃癌病理組織分化結果，中低分化 51 例、高分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期42例，Ⅱ期27例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例；有淋巴結轉移 40 例；腫瘤直徑<2.5 cm 38 例，≥2.5 cm 44 例。TNM 分期及病理分化程度參考第八版美國癌癥聯合會標準［10］。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 組織中miR-760 和BST2 mRNA 檢測 采用熒光實時定量PCR 技術。收集活檢或術中獲取的胃癌組織及癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm），應用TRIzol 法提取總RNA（RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司），使用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度，符合標準的RNA 凍存備用。使用RNA 逆轉錄試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）將提取出的RNA 進行反轉錄成cDNA，反轉錄條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以 cDNA 為模板，使用PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）進行PCR擴增，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-760 F：5"-TCTGGGTCTGT?GGGGAGTTG-3"，R：5"-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3"；內參GAPDH F：5"-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3"，R：5"-CAAAGTTGTCATGGATGATCC-3"；BST2mRNA F：5"-TGTCGCAATGTCACCCATCT-3"，R：5"-CTTCTCAGTCGCTCCACCTC-3"；內參U6 F：5"-GAG?GCACAGCGGAACG-3"，R：5"-CTACCACATAGTC?CAGG-3"。反應體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA 聚合酶，0.5 μL 上下游引物和 8 μL H2O。qPCR 反應條件：95 ℃ 預變性 5 min，55 ℃ 變性1 min，72 ℃延伸10 s，共40 個循環。每個樣本至少重復3次試驗，最后采集熒光信號，以2-ΔΔCt法計算miR-760和BST2 mRNA的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以-x±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson 線性相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-760、BST2 mRNA表達比較 miR-760 在胃癌及癌旁組織中的相對表達量分別為 0.023 ± 0.008、0.031 ± 0.010，兩者相比P<0.01。BST2 mRNA 在胃癌及癌旁組織中的相對表達量分別為 0.034 ± 0.011、0.017 ± 0.007，兩者相比P<0.01。

2.2 胃癌組織中miR-760、BST2 mRNA 的表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 胃癌組織中miR-760、BST2 mRNA的表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 表達的關系 胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 的表達呈負相關（r=-0.545，P<0.05）。

3 討論

胃癌是最常見消化系統腫瘤之一，是世界上癌癥相關死亡的第三大誘因［11］，在世界各國發病率也存在很大差異。食用含高鹽或高硝酸鹽食物、飲酒和吸煙是胃癌發生的主要危險因素［12］。除了遺傳易感性之外，家族中有胃癌患者亦是高危因素之一。早期胃癌臨床癥狀并不明顯，不易引起重視，因此部分患者診斷時已是晚期，常伴有遠處轉移，治愈率低、易復發且預后差。因此，尋找有意義的胃癌生物學指標是醫療工作者一大重要任務。

miRNA 是一類小的非編碼單鏈RNA，在多種腫瘤細胞中均表達，如乳腺癌、結腸癌等［11］，通過調節癌細胞的增殖、分化遷移過程，進而參與腫瘤的發生發展。近年來研究表明，miRNA 在胃癌中常呈異常表達狀態，如miR-532 在胃癌中表達上調，通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進了細胞增殖、遷移及浸潤過程［13］。miR-760亦是miRNA的一種，miR-760在卵巢癌表達上調，并通過下調PH 域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶2的表達進而促進卵巢癌細胞的增殖分化過程［14］。但是miR-760 在胃癌中的作用機制尚不明確。本研究結果顯示，胃癌組織中miR-760 的相對表達量低于癌旁組織，且腫瘤TNM 分期越高、細胞分化程度越低或發生淋巴結轉移時，胃癌組織中miR-760表達水平越低，說明了miR-760的表達水平與腫瘤TNM 分期、細胞分化程度及淋巴結轉移有關。有文獻顯示，過表達的miR-760 可通過下調下游靶基因ROS1 的表達進而抑制癌細胞的增殖分化及遷移，停滯腫瘤細胞的生長周期［15］；CAO 等［16］研究發現，過表達的miR-760 可靶向抑制重組人堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子ATF 樣蛋白3/激活子蛋白1 信號通路，進而影響抑制靶基因cyclinD1的表達，從而實現抑制腫瘤細胞生長、遷移的作用。而當組織中miR-760 表達減少時，其抑制腫瘤細胞增殖的功能減弱，間接的對腫瘤細胞的生長分化起促進作用，促進腫瘤的惡性進展。此外，miR-760 還可抑制其另一靶基因細胞因子信號轉導抑制因子3（SOCS-3）的表達，進一步下調SOCS3 的抑制腫瘤細胞增殖的作用，在一定程度上實現了促進腫瘤細胞的增殖分化及淋巴結轉移的作用，提高了腫瘤的臨床分期，增加了腫瘤的惡性程度，給臨床治療帶來了極大挑戰［17］。

BST2 是由180 個氨基酸組成的單次Ⅱ型跨膜蛋白，相對分子質量為35 kD，其基因位于染色體19p13.2。BST2 主要由四部分組成，分別為N 端、C端、跨膜區及胞外螺旋區［18］。BST2具有多種生物學功能，如調節B 細胞的生長、抑制人類免疫缺陷病毒1 的復制及抑制不同種包膜病毒，如埃博拉病毒和單純皰疹病毒從細胞釋放的過程［19］。相關研究表明，BST2參與多種癌癥的發生發展，如口腔癌、乳腺癌及子宮內膜癌等［20］。但是BST2 在胃癌中的分子作用機制還尚不清楚。本研究結果顯示，胃癌組織中BST2 mRNA 的相對表達量高于癌旁組織。原因可能為：BST2 是 miR-760 的靶基因之一，miR-760 可與BST2 結合從而下調BST2 的表達，當胃癌組織中miR-760 表達降低時，其下調BST2 表達的功能降低，使得癌組織中BST2的表達提高［21］。本研究結果還顯示，BST2 mRNA 的相對表達量與腫瘤細胞分化程度、TNM 分期及淋巴結轉移有關。BST2核酸序列中有與轉錄激活因子3（STAT3）的結合位點，當STAT3 與 BST2 結合時，激活了 BST2 的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移等過程，從而在腫瘤的發生發展中起到促進作用，提高了腫瘤的臨床分期與惡性程度［18］。另一方面，過表達的BST2可抑制核轉錄因子信號通路，促進磷酸化IκBα 和p65 的表達，促進腫瘤細胞的生長，并上調抗凋亡基因的表達，抑制腫瘤細胞的凋亡過程，從而對腫瘤的發生、侵襲和轉移發揮重要作用［22］。BST2 還可通過激活基質金屬蛋白酶2的表達進而促進癌細胞的生長和運動過程，進一步促進腫瘤細胞的遷移進而侵襲［23］。

本研究胃癌組織中miR-760 與BST2 的表達呈負相關，原因可能是BST2 是miR-760 的靶基因，高表達的miR-760 可以抑制腫瘤細胞的生長，BST2 具有促進腫瘤發生發展的作用，兩者共同在腫瘤的生長過程中發揮了重要作用。

綜上所述，胃癌組織中miR-760 表達降低，BST2 mRNA 表達升高，兩者均與腫瘤TNM 分期、腫瘤細胞分化程度及淋巴結轉移有關，有望在胃癌診斷、治療及預后評估中發揮重要作用。但兩者在胃癌發生發展過程中的具體作用機制還需要大樣本多中心的研究深入探討。